Sirt3誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞線粒體蛋白去乙酰化對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化影響的研究.pdf

1、目的：研究巨噬細(xì)胞線粒體 Sirt3基因的表達(dá)對(duì)線粒體蛋白去乙?；恼T導(dǎo)作用對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響，從而探索其與巨噬細(xì)胞泡沫化的關(guān)系及作用機(jī)制，及對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的影響。
　　方法：為了提供有說服力的結(jié)果，分別對(duì) Sirt3基因進(jìn)行干擾與過表達(dá)，從正反兩方面進(jìn)行下列研究：
　　1.構(gòu)建Sirt3干擾及過表達(dá)慢病毒載體。
　　2.以C57BL/6 J小鼠為模型動(dòng)物，構(gòu)建Sirt3基因干擾及過表達(dá)小鼠模型，并以C57 BL

2、/6J小鼠為對(duì)照分組進(jìn)行高脂與普通飼料飼養(yǎng)，于飼養(yǎng)的0、4及8周采集血樣進(jìn)行血清甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、白介素6和 C-反應(yīng)蛋白的檢測(cè)；同時(shí)解剖小鼠，取其頸總動(dòng)脈進(jìn)行 HE、彈力纖維染色及 Masson染色檢測(cè)；以 RT-PCR檢測(cè)小鼠頸動(dòng)脈血管組織Sirt3基因表達(dá)，以 WB檢測(cè)小鼠頸動(dòng)脈血管組織 Sirt3蛋白及IDH2蛋白乙酰化檢測(cè)。
　　3.通過腹腔灌洗法收集 C57BL/6J小鼠巨噬細(xì)

3、胞，構(gòu)建 Sirt3基因干擾及過表達(dá)巨噬細(xì)胞模型，并與 ox-L DL共培養(yǎng)后， RT-PCR檢測(cè) Sirt3基因表達(dá)，以 western blotting(WB)檢測(cè)Sirt3及乙?；疘D H2蛋白檢測(cè)，并以尼羅紅染色流式分析細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量。
　　結(jié)果：
　　1．干擾及過表達(dá)載體構(gòu)建：以慢病毒為載體，酶切電泳及測(cè)序均證實(shí)，成功構(gòu)建了靶向Sirt3的干擾病毒載體GPH-SIRT3-SH2及過表達(dá)病毒載體LV5-Sirt3，其

4、滴度均為3×108 TU/ml。
　　2．動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：
　　血清學(xué)指標(biāo)：高脂飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組血清甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、白介素6與 C-反應(yīng)蛋白均高于普通飼料飼養(yǎng)組（p<0.05），提示高脂模型小鼠建模成功。
　　S irt3干擾小鼠經(jīng)高脂飼養(yǎng)后，血清甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇及白介素6與C-反應(yīng)蛋白明顯高于正常組及過表達(dá)組（p<0.05），但高密度脂蛋白膽固醇無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）；而過表達(dá)

5、組與正常組差異不明顯（p>0.05）；
　　S irt3 mR NA表達(dá)及蛋白含量與乙?；?IDH2含量：干擾組小鼠Sirt3 mRNA表達(dá)及蛋白較對(duì)正常照小鼠及過表達(dá)小鼠明顯降低（p<0.05），乙?；疘DH2蛋白含量增高（p<0.05）；過表達(dá)組Sirt3 m RNA表達(dá)及蛋白較正常對(duì)照組增加（p<0.05），但I(xiàn) DH2蛋白乙?；綗o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。
　　血管病理學(xué)檢查：HE染色顯示，通過對(duì)干擾及過表達(dá)正

6、反研究發(fā)現(xiàn)，相同高脂飼養(yǎng)條件下S irt3表達(dá)被干擾后，C57BL/6 J小鼠頸動(dòng)脈血管壁增生明顯；Mas son及彈力纖維染色顯示血管局部膠原纖維增生，彈力纖維退化；而過表達(dá)Sirt3則能有效減緩這一病理進(jìn)程。
　　3、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)：
　　巨噬細(xì)胞經(jīng)Sirt3慢病毒感染后正反研究顯示：當(dāng)Sirt3基因表達(dá)被干擾后，細(xì)胞線粒體IDH2蛋白乙酰化程度升高；而Sirt3處于過表達(dá)時(shí)，IDH2蛋白乙?；潭茸畹?。Sirt3干擾后，巨

7、噬細(xì)胞內(nèi)ox-LDL蓄積程度較正常巨噬細(xì)胞及過表達(dá)組嚴(yán)重，而過表達(dá)組則少見脂質(zhì)蓄積；
　　結(jié)論：通過動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) Sirt3在高脂飼養(yǎng)小鼠中表達(dá)量的改變后，設(shè)計(jì)構(gòu)建以慢病毒為 Sir t3載體進(jìn)行在體干擾及過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，探索 Sirt3表達(dá)量的改變對(duì)高脂飼養(yǎng)小鼠模型的作用。因 Sirt3存在于所有細(xì)胞的線粒體中，因此，通過分離巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，對(duì)巨噬細(xì)胞線粒體中 Sirt3進(jìn)行干擾及過表達(dá)，研究其對(duì)巨噬細(xì)胞生理功能的影