自然殺傷細(xì)胞受體NKp80與NKG2F的生物學(xué)功能研究.pdf

1、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)是固有免疫系統(tǒng)中非常重要的成員，能夠有效的清除機(jī)體內(nèi)的異常細(xì)胞，包括受到病原微生物感染的細(xì)胞和發(fā)生癌變的細(xì)胞。與T細(xì)胞不同，NK細(xì)胞可以直接識(shí)別異常信號(hào)，不需要抗原遞呈細(xì)胞對(duì)抗原進(jìn)行加工、遞呈，能夠快速對(duì)機(jī)體內(nèi)的異常信號(hào)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，是機(jī)體的第一道免疫防線。
　　 NK細(xì)胞能夠有效的區(qū)分機(jī)體內(nèi)的正常細(xì)胞和異常細(xì)胞，主要通過(guò)表達(dá)于NK細(xì)胞表面的NK細(xì)胞受體來(lái)完成自我與非我的識(shí)別過(guò)程。目前解釋該現(xiàn)象公認(rèn)的理論

2、為“Missing Self”機(jī)制：機(jī)體正常細(xì)胞表面表達(dá)足量的HLA分子，它們能夠結(jié)合位于NK細(xì)胞表面的抑制性受體(人白細(xì)胞抗原特異性抑制受體)，抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性;而在感染或癌變的細(xì)胞表面，HLA分子缺失或表達(dá)量大幅降低，不能有效的抑制NK細(xì)胞的殺傷功能，導(dǎo)致其被NK細(xì)胞清除。
　　 NK細(xì)胞受體根據(jù)它們傳導(dǎo)的信號(hào)不同，主要分為活化性受體和抑制性受體。它們對(duì)于NK細(xì)胞發(fā)揮各項(xiàng)生物學(xué)功能起著至關(guān)重要的作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大

3、量NK細(xì)胞受體，其中部分受體的生物學(xué)功能研究得已比較透徹，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了相應(yīng)的配體，制備了單克隆抗體，解析了三維空間結(jié)構(gòu)等。但是隨著NK細(xì)胞受體研究不斷向前進(jìn)展，新的NK細(xì)胞受體不斷被發(fā)現(xiàn)，它們的生物學(xué)功能尚不明晰。
　　 NKp80和NKG2F是新近發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)NK細(xì)胞受體，目前關(guān)于它們的研究較少，生物學(xué)功能尚不清楚，我們的工作主要圍繞這兩個(gè)NK細(xì)胞受體展開(kāi)，旨在更進(jìn)一步了解這兩個(gè)NK細(xì)胞受體的生物學(xué)功能。
　　 之前的兩項(xiàng)

4、研究發(fā)現(xiàn)NKp80能夠向NK細(xì)胞內(nèi)傳遞活化信號(hào)，增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，提高NK細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子的能力；同時(shí)還鑒定出了NKp80的配體——表達(dá)于單核細(xì)胞上的AICL分子。然而，目前NKp80和AICL的三維空間結(jié)構(gòu)都未被解析，無(wú)法根據(jù)三維空間結(jié)構(gòu)來(lái)推測(cè)它們相互結(jié)合的位點(diǎn)，難以了解它們相互作用的機(jī)理。為了探究NKp80與AICL相互作用的位點(diǎn)，我們首先在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)中找到了目前已經(jīng)解析了三維空間結(jié)構(gòu)、且同源性與AICL最

5、高的蛋白分子CD69，然后根據(jù)CD69的三維空間結(jié)構(gòu)，利用生物信息學(xué)工具3D-JIGSAW構(gòu)建了AICL的模擬空間結(jié)構(gòu)。
　　 隨后在所有生物總蛋白庫(kù)中對(duì)AICL氨基酸序列進(jìn)行BLAST分析，找出同源性最高的7個(gè)蛋白，用ClustalW2軟件分析比對(duì)這8個(gè)蛋白的氨基酸序列，在AICL氨基酸序列中確定出7個(gè)保守性區(qū)域。
　　 在AICL的模擬空間結(jié)構(gòu)中展示這7個(gè)保守性區(qū)域發(fā)現(xiàn)，其中三個(gè)保守性區(qū)域位于AICL的模擬空間結(jié)構(gòu)的

6、外表面，按照這三個(gè)保守性序列合成了三條多肽。
　　 流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)這三條多肽能夠競(jìng)爭(zhēng)性的抑制anti-NKp80單克隆抗體結(jié)合NK細(xì)胞表面的NKp80。細(xì)胞毒活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中的兩條多肽能夠部分阻斷NKp80與AICL所介導(dǎo)的NK細(xì)胞的殺傷功能。結(jié)合生物信息學(xué)分析和功能實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們認(rèn)為兩條多肽序列為潛在的分子相互作用位點(diǎn)。
　　 NKG2F的功能目前尚不清楚，之前的研究顯示NKG2F胞內(nèi)段有一個(gè)類(lèi)似于免疫

7、受體酪氨酸抑制性基序(ITIM)的序列，但在細(xì)胞膜表面，它又能與DAP12結(jié)合，通過(guò)DAP12胞內(nèi)的免疫受體酪氨酸活化性基序(ITAM)傳遞活化信號(hào)。NKG2F是活化性受體還是抑制性受體，尚存在爭(zhēng)論。我們第一次利用重組表達(dá)技術(shù)，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)出了人NKG2F重組蛋白，然后以重組人NKG2F為免疫原，免疫小鼠制備了anti-NKG2F多克隆抗體，以此為工具，通過(guò)熒光定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞因子IL-2和IL-15活化