細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子E2F1對(duì)下游基因的調(diào)控及其生物學(xué)功能研究.pdf

1、細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子E2F1是E2F家族中第一個(gè)被克隆出來的蛋白,對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡都發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。E2F1參與了細(xì)胞周期從G1期到S期的轉(zhuǎn)換:在細(xì)胞周期G1期前,Rb與E2F1結(jié)合限制了其活性,當(dāng)細(xì)胞周期蛋白激酶CDK結(jié)合蛋白R(shí)b后,磷酸化的Rb釋放E2F1/DP-1復(fù)合物,這樣E2F1/DP-1就結(jié)合到基因組上,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能激活下游基因,進(jìn)而使細(xì)胞周期從G1期轉(zhuǎn)換到S期。同時(shí),E2F1還發(fā)揮促凋亡功能,通過p53依賴

2、型以及p53非依賴型兩種細(xì)胞信號(hào)通路,進(jìn)而激活下游促凋亡蛋白如:Bcl-2 homology3(BH3)-only proteins PUMA,Noxa,Bim,Hrk/DP5,Bik以及Caspase-3,-9等;此外,E2F1還抑制細(xì)胞存活信號(hào)通路分子如:NF-κB,Mcl-1等。通過E2F1這兩方面的作用,最終帶來細(xì)胞的凋亡。因此,轉(zhuǎn)錄因子E2F1與腫瘤的治療有很密切的關(guān)系,以E2F1作為腫瘤藥物靶點(diǎn)的研究顯得尤為重要。
　

3、　 由于轉(zhuǎn)錄因子E2F1在細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用,為了研究E2F1對(duì)其下游基因的調(diào)控,本論文利用穩(wěn)定表達(dá)ER-E2F1即雌激素受體與E2F1的融合蛋白的H1299細(xì)胞株進(jìn)行研究。該細(xì)胞株能夠穩(wěn)定表達(dá)大量融合蛋白ER-E2F1,這樣細(xì)胞內(nèi)這些融合蛋白就會(huì)與細(xì)胞膜上的大量配體相結(jié)合,從而將ER-E2F1固定在細(xì)胞核之外。當(dāng)加入雌激素受體抑制劑(4-OHT)處理一段時(shí)間后,ER-E2F1與細(xì)胞膜上的配體的結(jié)合就會(huì)被打斷,大量

4、的ER-E2F1就會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮E2F1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。本論文首先是建立并通過G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)HA-ER-E2F1融合蛋白的H1299細(xì)胞株;其次,在雌激素受體抑制劑(4-OHT)處理的情況下,通過western blot技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)E2F1能夠在蛋白水平上激活下游蛋白DP-1和B-Raf;再次,用細(xì)胞株H1299和Hela,在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒HA-E2F1的情況下,通過western blot技術(shù)和免疫熒光染色技術(shù)分別證實(shí)E2F

5、1在蛋白水平上激活下游蛋白DP-1和B-Raf;最后,利用H1299細(xì)胞株,在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒HA-E2F1的情況下,通過Rt-PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),E2F1在轉(zhuǎn)錄水平上激活DP-1.
　　 在本論文所建立的E2F1對(duì)其下游基因調(diào)控的穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)中,融合蛋白ER-E2F1在細(xì)胞內(nèi)是大量表達(dá)的,我們只是通過雌激素受體抑制劑(4-OHT)來改變?cè)摰鞍椎募?xì)胞空間定位,進(jìn)而在人為可控的情況下來研究E2F1對(duì)其下游基因的調(diào)控。我們的結(jié)果第一次揭