血管緊張素Ⅱ?qū)w外培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞生物學(xué)特性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:通過組織塊酶消化法進(jìn)行人牙髓細(xì)胞的原代培養(yǎng)以獲得大量可供實(shí)驗(yàn)用的牙髓細(xì)胞，建立人牙髓細(xì)胞的體外研究模型。研究不同濃度的AngⅡ?qū)w外培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞增殖效應(yīng)、細(xì)胞周期進(jìn)程、遷移等一系列生物學(xué)活性的影響。
　　方怯:
　　1.選取符合納入標(biāo)準(zhǔn)的新鮮拔除健康牙（均經(jīng)患者知情同意），在無菌條件下拔出牙髓組織，通過組織塊酶消化法進(jìn)行牙髓細(xì)胞的原代培養(yǎng)，顯微鏡下觀察組織塊的解離情況，細(xì)胞的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)和生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80

2、％鋪滿瓶底后，用0.25％胰酶消化按1∶1進(jìn)行細(xì)胞首次傳代，以后傳代按1∶3比例進(jìn)行，取生長(zhǎng)狀況良好的第4代人牙髓細(xì)胞，胰酶消化后制備成細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞爬片，用SABC法進(jìn)行波形蛋白和角蛋白免疫組化染色鑒定細(xì)胞來源。HE染色觀察細(xì)胞的組織學(xué)形態(tài)。
　　2.取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第4代人牙髓細(xì)胞，0.25％胰酶消化，用含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度為2×104個(gè)/ml，接種于96孔板，每孔加液量200μL。隨

3、機(jī)分為五個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組，每組復(fù)五孔。恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，棄孔內(nèi)原培養(yǎng)液，PBS緩沖液沖洗3遍。在相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組的孔內(nèi)加入200μL含5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制的AngⅡ溶液(10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L)，對(duì)照組加入等量的含5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，于24h、48h、72h各取出一塊96孔板，加入CCK-8溶液，37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)

4、孵育2h，酶標(biāo)儀上450nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔吸光度值（OD值）。
　　3.取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第4代人牙髓細(xì)胞，用0.25％的胰蛋白酶消化后，1000r/min離心5min，棄上清液，加完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度為2×104個(gè)/ml，接種在25ml的培養(yǎng)瓶中，每瓶加液量3ml。隨機(jī)分為兩組，每組復(fù)三瓶，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。棄瓶?jī)?nèi)原培養(yǎng)液，PBS緩沖液沖洗3遍，實(shí)驗(yàn)組相應(yīng)的瓶?jī)?nèi)加入3ml含5％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液配制的10-7

5、mol/L AngⅡ溶液，對(duì)照組加入等量含5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)牙髓細(xì)胞48h，消化，離心，收集細(xì)胞，加入-20℃預(yù)冷70％的乙醇，4℃過夜固定樣本，按照細(xì)胞周期試劑盒說明書操作，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析AngⅡ?qū)ρ浪杓?xì)胞的DNA合成，細(xì)胞周期進(jìn)程的影響。
　　4.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。取生長(zhǎng)良好的第4代人牙髓細(xì)胞，0.25％胰蛋白酶消化，1000r/min離心5min，棄上清液，用完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞制備成濃度為

6、1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，以每孔100μL加液量接種于Transwell小室的上室內(nèi)。恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，顯微鏡下觀察到細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好后，換用含1％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)牙髓細(xì)胞24h進(jìn)行細(xì)胞周期同步化處理，棄原孔內(nèi)培養(yǎng)液，DMEM培養(yǎng)液沖洗，隨機(jī)分為五個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組所有孔的上室內(nèi)均加入100μL不含血清的DMEM培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組下室內(nèi)加入600μL DMEM培養(yǎng)液配制的不同濃度（10-9mol/L、

7、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L）的AngⅡ溶液，對(duì)照組下室內(nèi)加入等量DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，下室內(nèi)有無牙髓細(xì)胞。用眼科鑷取出Transwell小室，棉簽輕輕拭去小室濾膜內(nèi)表面的牙髓細(xì)胞，37℃ PBS浸洗，70％酒精固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)各組的穿膜細(xì)胞數(shù)。
　　結(jié)果:
　　1.通過組織塊酶消化法進(jìn)行牙髓細(xì)胞的原代培養(yǎng)所獲得的細(xì)胞形

8、態(tài)均一為典型的梭性，胞體豐滿，胞漿豐富，圓形或橢圓形的細(xì)胞核位于細(xì)胞中央。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果示波形絲蛋白染色陽(yáng)性，角蛋白染色陰性。符合牙髓細(xì)胞組織學(xué)表現(xiàn)。
　　2.與對(duì)照組相比，一定濃度范圍內(nèi)（10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L）的AngⅡ均能促進(jìn)體外培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞的增殖效應(yīng)。且在這一濃度范圍內(nèi)，AngⅡ?qū)ρ浪杓?xì)胞的促增殖作用呈現(xiàn)濃度依賴性。與對(duì)照組相比，AngⅡ可促進(jìn)細(xì)胞DNA合成，推進(jìn)牙髓細(xì)胞的細(xì)胞

9、周期進(jìn)程(P＜0.05)。
　　3.與對(duì)照組相比，在一定濃度范圍內(nèi)（10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L）的AngⅡ均能促進(jìn)體外培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞的遷移作用。且在該濃度范圍內(nèi)，AngⅡ?qū)ρ浪杓?xì)胞的促遷移作用呈濃度依賴性(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.采用組織塊酶消化法可成功培養(yǎng)出牙髓細(xì)胞，培養(yǎng)所得的細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，組織來源鑒定結(jié)果等均符合人牙髓細(xì)胞生物學(xué)特性。
　　2.一定濃度范圍內(nèi)，