氯通道ClC-7對(duì)牙囊細(xì)胞生物學(xué)特性影響的體外研究.pdf

1、電壓門控氯離子ClC家族成員在不同的生物類群中均有分布，并具有不同的生物學(xué)作用，如穩(wěn)定膜電壓、離子轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞器酸化等。ClC家族成員的重要性表現(xiàn)在某些氯離子通道基因的缺陷能導(dǎo)致遺傳性疾病的發(fā)生，如:先天性肌強(qiáng)直、Dent's病、骨硬化癥、原發(fā)性癲癇等。ClC家族包括三個(gè)亞類，共有9個(gè)家族成員，它們分別是ClC-1～7，ClC-Ka，ClC-Kb。ClC家族的第三支包括ClC-6和ClC-7，它們?cè)谠S多不同類型的組織上都有表達(dá)，發(fā)揮著調(diào)節(jié)

2、胞內(nèi)細(xì)胞器囊泡pH值的作用。ClC-7是這個(gè)離子通道家族中表達(dá)最廣泛的成員之一，存在于晚期胞內(nèi)體、溶酶體和破骨細(xì)胞的皺褶緣膜中。人類ClC-7是由CLCN7基因編碼的，其功能異常影響破骨細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞外酸化作用，導(dǎo)致骨無機(jī)物的溶解障礙和一系列的臨床癥狀。
　　在本課題組前期的臨床和基礎(chǔ)研究中，發(fā)現(xiàn)牙的發(fā)育和ClC-7分子密切相關(guān)。一方面，CLCN7基因突變所引起的骨硬化癥患者可出現(xiàn)牙根發(fā)育不全及牙萌出受阻，部分牙有釉質(zhì)發(fā)育不全等異

3、常表現(xiàn);另一方面，CLC-7蛋白在小鼠牙胚發(fā)育的各個(gè)階段均有表達(dá)。據(jù)此推測ClC-7在牙發(fā)育和萌出中可能起著重要的作用。牙囊起源于外胚間充質(zhì)，是包繞在成釉器周圍和牙乳頭底部的呈囊狀排列的結(jié)締組織，其在牙齒萌出后期形成牙骨質(zhì)、牙周膜和固有牙槽骨。牙囊是牙萌出的必需條件之一，其在組織、細(xì)胞和分子多個(gè)水平上調(diào)控牙齒的萌出。
　　目的：
　　基于牙囊細(xì)胞在牙發(fā)育和萌出中的重要地位，為了驗(yàn)證ClC-7在牙萌出中發(fā)揮重要功能的假說，本實(shí)

4、驗(yàn)采用小鼠牙囊細(xì)胞(Dental Follicle Cells，DFCs)為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?首先探索小鼠牙囊細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的合適方法，其次檢測ClC-7在DFCs的表達(dá)情況，并通過構(gòu)建慢病毒shRNA載體干擾DFCs中ClC-7的表達(dá)，建立ClC-7缺陷的小鼠牙囊細(xì)胞模型，觀察ClC-7表達(dá)降低后相關(guān)基因的變化;在體外模擬成骨細(xì)胞和破骨前體細(xì)胞的相互作用，建立DFCs/MNCs（骨髓單核細(xì)胞）直接共培養(yǎng)體系，檢測DFCs中ClC-7表達(dá)

5、降低后對(duì)形成破骨細(xì)胞分化和功能的影響;通過采用人工成熟配方的礦化誘導(dǎo)液和模擬天然環(huán)境的牙本質(zhì)浸提液，分別對(duì)DFCs進(jìn)行誘導(dǎo)，檢測兩種誘導(dǎo)液對(duì)DFCs成骨/成牙本質(zhì)/成牙骨質(zhì)分化中相關(guān)基因表達(dá)的影響，檢測DFCs中ClC-7表達(dá)降低后對(duì)成骨/成牙本質(zhì)/成牙骨質(zhì)分化中相關(guān)基因表達(dá)和對(duì)礦化結(jié)節(jié)形成能力的影響。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)一:采用出生后3～5天的仔鼠，二次酶消化法分離牙囊細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，觀察各代牙囊細(xì)胞生長狀態(tài)和特點(diǎn)，通

6、過免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測波形蛋白和角蛋白在所分離細(xì)胞的表達(dá)情況，鑒定細(xì)胞來源。
　　實(shí)驗(yàn)二:構(gòu)建慢病毒Clcn7-shRNA載體并體外轉(zhuǎn)染DFCs，qRT-PCR檢測其對(duì)ClC-7表達(dá)水平的干擾效果，并且檢測ClC-7沉默后對(duì)DFCs破骨和成骨等相關(guān)功能分子表達(dá)水平變化的影響，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測CLC-7在DFCs的表達(dá)情況。
　　實(shí)驗(yàn)三:建立DFCs/MNCs共培養(yǎng)體系，通過TRAP染色和牙片吸收實(shí)驗(yàn)，即分別計(jì)數(shù)形成多

7、核破骨樣細(xì)胞的數(shù)目、牙片上形成吸收陷窩的數(shù)目和面積，檢測降低DFCs的ClC-7表達(dá)水平后對(duì)共培養(yǎng)體系中破骨細(xì)胞分化和功能的影響。
　　實(shí)驗(yàn)四:采用礦化誘導(dǎo)液和牙本質(zhì)浸提液對(duì)DFCs進(jìn)行誘導(dǎo)，qRT-PCR檢測兩種誘導(dǎo)液對(duì)DFCs成骨/成牙本質(zhì)/成牙骨質(zhì)分化相關(guān)基因表達(dá)的影響，檢測降低DFCs ClC-7表達(dá)水平后對(duì)以上基因表達(dá)水平的影響，茜素紅染色檢測礦化誘導(dǎo)液在降低DFCs的ClC-7表達(dá)水平后對(duì)其礦化結(jié)節(jié)形成能力的影響。

8、r>　　結(jié)果:
　　1.采用二次酶消化法分離培養(yǎng)小鼠牙囊細(xì)胞，24小時(shí)后見散在細(xì)胞集落生成。細(xì)胞呈放射狀或漩渦狀生長，為典型成纖維細(xì)胞表現(xiàn)。3～5天細(xì)胞集落融合，鋪滿板底。細(xì)胞呈現(xiàn)為多突起的梭形細(xì)胞和多角形細(xì)胞兩種細(xì)胞形態(tài)混雜生長，兩種細(xì)胞群體之間界限不清。體外培養(yǎng)3～5天細(xì)胞生長接近融合，傳代12h后細(xì)胞恢復(fù)形態(tài)貼壁生長，大部分呈梭形，多角形細(xì)胞比例減少。第三代細(xì)胞生長速度最快，2～3天細(xì)胞數(shù)量倍增，細(xì)胞大小較為一致，胞體較豐滿

9、，立體感強(qiáng)，細(xì)胞呈多形型，部分細(xì)胞呈樹突型或水滴型，多角形細(xì)胞基本消失。第四代細(xì)胞生長速度明顯下降，細(xì)胞表面積變大，形態(tài)異型性明顯，胞體趨于扁平，含2個(gè)胞核的細(xì)胞增多。第五代細(xì)胞生長接近停滯，表面積和形態(tài)變化、細(xì)胞間差異更為明顯。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示分離培養(yǎng)細(xì)胞為波形蛋白VIM呈陽性表達(dá)，角蛋白CK呈陰性表達(dá)。
　　2.慢病毒轉(zhuǎn)染DFCs72h后，熒光顯微鏡下大部分的細(xì)胞可見綠色GFP熒光，qRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Clcn7-s

10、hRNA慢病毒載體能顯著下調(diào)ClC-7在DFC中的表達(dá)水平。進(jìn)一步通過qRT-PCR檢測成骨相關(guān)功能分子Opg、Bsp、Opn、Oc、Alp、Bmp2、Col1釉質(zhì)和牙本質(zhì)的基質(zhì)蛋白分子Dspp、Dmp1、Amelogenin、Enamelin和成牙骨質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子Cap在DFCs中mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示Opg、Opn、Alp、Cap、Rank、Ctsk、M-csf、 Rankl、Runx2和Tfgb1在DFCs中的表達(dá)較高，其它分

11、子Dspp、Dmp1、Amelogenin、Enamelin、Oc、Bsp、Bmp2、Trap在DFCs中幾乎不表達(dá)或痕量表達(dá)。和negative-shRNA轉(zhuǎn)染組相比，Clcn7-shRNA轉(zhuǎn)染組Opg發(fā)生上調(diào)，Opn、Alp、Cap、Rankl發(fā)生下調(diào)并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Rank、Ctsk、M-csf和Tfgb1有上調(diào)趨勢(shì)但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在蛋白表達(dá)水平方面，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法結(jié)果表明CLC-7在DFCs中呈陽性表達(dá)。
　　3.

12、DFCs/MNCs共培養(yǎng)期間可見到MNCs貼壁聚集成結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu)，DFCs在鏡下呈類圓形且較為通透多突觸的神經(jīng)元樣細(xì)胞，MNCs圍繞DFC并聚集在其周圍。DFCs/MNCs共培養(yǎng)7天后能看到眾多TRAP陽性細(xì)胞，其中有一部分為多核細(xì)胞。共培養(yǎng)14天后掃描電鏡下能看到牙片上有散在的吸收陷窩。TRAP染色計(jì)數(shù)Clcn7-shRNA組的多核TRAP陽性細(xì)胞數(shù)目少于negative-shRNA組和空白對(duì)照組，negative-shRNA組和空白對(duì)

13、照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。牙片吸收實(shí)驗(yàn)Clcn7-shRNA組的每視野牙片吸收陷窩數(shù)目少于negative-shRNA組空白對(duì)照組，Clcn7-shRNA組的平均吸收陷窩面積小于negative-shRNA組和空白對(duì)照組，negative-shRNA組和空白對(duì)照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.采用礦化誘導(dǎo)液對(duì)DFCs進(jìn)行誘導(dǎo)3天，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示成骨分化相關(guān)基因Bsp、Opn、Alp、Coll，成牙骨質(zhì)分化相關(guān)基因Cap和重要

14、信號(hào)通路分子Tgfb1的mRNA水平均發(fā)生了明顯的上調(diào)，其中Bsp、Opn和Cap的上調(diào)幅度達(dá)數(shù)十倍甚至數(shù)百倍;采用Cln7-shRNA慢病毒載體降低DFCs中Clcn7的表達(dá)水平，礦化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)3天，Bsp、Alp、Col1和Tgfb1的mRNA水平均發(fā)生了明顯的上調(diào)。采用慢病毒載體降低DFCs中Clcn7的表達(dá)水平，礦化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)7、14、21天，茜素紅染色和茜素紅溶解定量實(shí)驗(yàn)顯示Clcn7抑制組和對(duì)照組形成礦化結(jié)節(jié)的能力無差異。采

15、用牙本質(zhì)浸提液對(duì)DFCs進(jìn)行誘導(dǎo)3天，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示成骨分化相關(guān)基因Bsp、Opn、Alp、Col1和重要信號(hào)通路分子Tgfb1的mRNA水平均發(fā)生了明顯的上調(diào)，其中Bsp、Opn的上調(diào)幅度達(dá)百倍以上;采用Clcn7-shRNA慢病毒載體降低DFCs中Clcn7的表達(dá)水平后進(jìn)行牙本質(zhì)浸提液誘導(dǎo)3天，所檢測基因分子的mRNA表達(dá)水平均發(fā)生不同程度的降低，其中成骨分化相關(guān)基因Bsp、Alp、Opn和重要信號(hào)通路分子Tgfb1的改

16、變較顯著。
　　結(jié)論:
　　1.采用二次酶消化法進(jìn)行小鼠牙囊細(xì)胞原代培養(yǎng)可在短時(shí)間內(nèi)獲得較多的細(xì)胞，操作簡便且成功率高，是一種較理想的小鼠牙囊細(xì)胞培養(yǎng)方法。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果證明分離的細(xì)胞為間充質(zhì)來源，結(jié)合取材部位，說明分離所得細(xì)胞為DFCs。應(yīng)選用狀態(tài)最佳的第三代小鼠牙囊細(xì)胞進(jìn)行各類實(shí)驗(yàn)。
　　2.ClC-7在DFCs中有豐富的表達(dá)。DFCs中ClC-7表達(dá)水平的降低導(dǎo)致成骨相關(guān)功能分子和RANK-RANKL-OP

17、G信號(hào)軸表達(dá)水平的改變，提示DFCs的功能可能與成骨細(xì)胞相似，ClC-7在DFCs中可能通過成骨途徑及RANK-RANKL-OPG信號(hào)軸發(fā)揮作用。
　　3.DFCs/MNCs共培養(yǎng)體系能模擬DFCs在牙萌出過程的募集和誘導(dǎo)作用，促進(jìn)MNCs分化為OCLs，降低DFCs的ClC-7表達(dá)水平導(dǎo)致OCLs數(shù)目減少及其骨質(zhì)吸收功能降低。
　　4.礦化誘導(dǎo)液能誘導(dǎo)DFCs向成骨/成牙骨質(zhì)向分化，而牙本質(zhì)浸提液僅能誘導(dǎo)DFCs向成骨方向