調(diào)控miR-141，miR-205表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞株生物學(xué)特性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：宮頸癌是全世界婦女中第三常見的惡性腫瘤。高危型HPV(Human Papillomavirus，人乳頭瘤病毒)的持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌及癌前病變的最重要原因。但僅有一部分高危型HPV感染者會(huì)發(fā)生宮頸癌或癌前病變，說(shuō)明高危型HPV感染不是唯一的病因，其它未知因素如基因水平的改變似乎也在疾病發(fā)生發(fā)展中起作用。 microRNAs(miRNAs)是一類可調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過(guò)與靶基因mRNA特異的堿基配對(duì)

2、結(jié)合，引起靶基因mRNA降解或者翻譯抑制，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后的靶基因沉默。研究表明，miRNAs通過(guò)調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。 本課題組的先期研究利用microRNAs芯片，篩選出HPV陽(yáng)性的宮頸腺癌、鱗癌組織與相應(yīng)的癌旁組織呈差異表達(dá)的microRNAs，發(fā)現(xiàn)microRNA—205(miR—205)在HPV陽(yáng)性的宮頸腺癌組織中表達(dá)下降，microRNA-141(miR-141)

3、在HPV陽(yáng)性宮頸鱗癌組織中表達(dá)升高。但兩種miRNAs在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的功能尚不清楚。 目的：1、在宮頸鱗癌細(xì)胞系中下調(diào)miR-141表達(dá)，在宮頸腺癌細(xì)胞系中上調(diào)miR—205表達(dá)。2、分別觀察調(diào)控miRNAs表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的變化。 方法：1、在宮頸鱗癌細(xì)胞系SiHa細(xì)胞中同法轉(zhuǎn)染miR-141的抑制分子(anti—miR-141)和陰性對(duì)照，在宮頸腺癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞中脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR—205前

4、體分子(miR—205 precursor)和陰性對(duì)照，熒光顯微鏡下觀察陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染情況。2、RealtimePCR法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后SiHa細(xì)胞中miR-141表達(dá)和HeLa細(xì)胞中miR—205表達(dá)。3、轉(zhuǎn)染后MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)。4、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖。5、Transwell小室法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力。6、流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率。7、流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期分布。 結(jié)果： 1、SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染

5、anti—miR-141后，miR-141表達(dá)下降為0.68倍。細(xì)胞克隆形成率及轉(zhuǎn)染后24、48、72小時(shí)各組活細(xì)胞數(shù)與陰性對(duì)照組比較無(wú)差異。實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞比例較陰性對(duì)照組降低(72.44％±2.17％，79.75％±3.23％)，G2/M期細(xì)胞比例升高(11.41％±1.36％，6.43％±1.18％)，兩組細(xì)胞的凋亡率、細(xì)胞遷移能力無(wú)明顯差異。 2、HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR—205 precursor后，miR—205

6、表達(dá)增高3061.5倍。細(xì)胞克隆形成率增加，為陰性對(duì)照組的1.25倍。但轉(zhuǎn)染后24、48、72小時(shí)，各組間活細(xì)胞數(shù)無(wú)差異。實(shí)驗(yàn)組S期細(xì)胞比例較對(duì)陰性照組降低(19.17％±2.00％，23.38％±1.56％)，G0/G1期比例升高(64.38％±2.14％，58.63％±2.71％)，而細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞遷移能力無(wú)明顯改變。 結(jié)論：1、成功地在宮頸癌細(xì)胞株中調(diào)控miRNAs的表達(dá)。2、在宮頸鱗癌中下調(diào)miR-141表達(dá)后，細(xì)胞周