廣州管圓線蟲烯醇化酶基因的克隆、表達及各期組織定位分析.pdf

1、廣州管圓線蟲(Angiostrongylus cantonensis)是一種嚴重的人畜共患自然疫源性寄生蟲，其第三期幼蟲(L3)可在福壽螺、魚、蝦等中間宿主中長期寄生，人因為誤食而感染，可引起嗜酸性粒細胞增多性腦膜腦炎等病癥。廣州管圓線蟲病嚴重危害了人們的健康，并且近來抗寄生蟲藥物和抗生素的泛濫使寄生蟲產(chǎn)生明顯的抗藥性，因此，從基因組學角度展開對廣州管圓線蟲防治的研究成為必然的發(fā)展趨勢。寄生蟲的能量代謝主要依靠糖酵解獲得能量，烯醇化酶是

2、糖酵解過程的至關(guān)重要的酶類，在生物的生命代謝活動中起到不可忽視的作用。
　　 本論文以廣州管圓線蟲為研究對象，以烯醇化酶基因作為研究的目的基因，對其克隆、表達、在各期蟲體定位定量分析。首先在NCBI中找到廣州管圓線蟲烯醇化酶基因部分序列，用cDNA末端快速擴增技術(shù)擴增5'和3'端部分，獲得基因全長，利用NCBI，SignalP4.1等多種在線分析軟件預(yù)測烯醇化酶的結(jié)構(gòu)及進行功能分析。根據(jù)基因全長設(shè)計引物，并構(gòu)建表達載體，原核表達

3、并純化其重組蛋白后用以制備多克隆抗體。并以該抗體為一抗對廣州管圓線蟲做各期蟲體的免疫組化研究。為測定烯醇酶在各期蟲體中的差異表達，我們進行了烯醇化酶在廣州管圓線蟲L1、L2、L3、L4、L5和成蟲雄蟲、雌蟲中實時熒光定量PCR。
　　 在烯醇化酶基因全長克隆后，已將序列上傳至GenBank，AcEno基因序列號為KC800926。廣州管圓線蟲烯醇化酶基因全長1667bp包含1350bp的編碼閱讀框(148-1452bp)，該基因

4、包括215 bp的3'UTR和147bp的5'UTR，編碼434個氨基酸，無信號肽序列，但具有一段明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域。
　　 廣州管圓線蟲各期蟲體中對烯醇化酶的免疫組化結(jié)果顯示烯醇化酶在一期到五期幼蟲均勻分布于整個蟲體，在雄蟲體壁縱肌層、腸道、睪丸、儲精囊、輸精管，雌蟲體壁縱肌層、腸道、子宮、卵巢均有大量的表達，主要是細胞質(zhì)表達，可以看出烯醇化酶主要分布于高能量代謝區(qū)域。由于其在各個組織中均有分布，因此我們傾向于將其歸類為一種結(jié)構(gòu)