血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、目的：
　　 觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)在不同濃度血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)作用下的生物學(xué)特性,探討VEGF對(duì)EPC生物學(xué)特性的影響。
　　 方法：
　　 無(wú)菌條件下分離脛骨和股骨,M199培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,收集沖洗液充分吹打混勻,加入裝有密度梯度為1.077 g/cm3的淋巴細(xì)胞分離液的離心管,沖洗液與分離液的體積比為2∶1。20℃下2000r/minFicoll-Histopaque梯度離心沉淀20min。吸

2、取中間乳白色云霧狀單個(gè)核細(xì)胞層,PBS沖洗細(xì)胞沉淀。以1×106/ml的密度接種到100ml培養(yǎng)瓶中。含20％胎牛血清的M199培養(yǎng)基,37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后重新接種未貼壁細(xì)胞。第3天半量換液,第5天全量換液。細(xì)胞達(dá)到80％以上融合時(shí),用0.25％胰酶(含1％EDTA)消化細(xì)胞。在第7天運(yùn)用流式細(xì)胞儀行細(xì)胞表型CD133、CD34鑒定。收集貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù),將等量EPC懸液200μl接種到96孔培養(yǎng)板,繼續(xù)培養(yǎng)2

3、d,用不含胎牛血清的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后,換含有不同濃度(0、10、50ng/ml)VEGF的培養(yǎng)液,每個(gè)濃度組重復(fù)5孔,培養(yǎng)24h后,每孔加MTT(5 g/L)20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4h后,吸棄上清液,再加入DMSO(150μl/孔),水平振蕩10min后置于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)560nm處,取5個(gè)孔吸光值(optical density OD)的平均值,得到最適濃度。以最適濃度按上述方法培養(yǎng),以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo),繪制細(xì)胞生長(zhǎng)

4、曲線。應(yīng)用24孔的Transwell(孔徑8μm)小室行體外遷移實(shí)驗(yàn)。上室為200μl EPC(1×104/ml)懸液,下室為含不同濃度(0、10、50 ng/ml)VEGF的M199培養(yǎng)液。37℃下培養(yǎng)24h,將上室附著細(xì)胞用濕棉簽擦去,固定,Giemsa染色,脫色,拍照(×200),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。倒置顯微鏡計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞。體外血管生成能力檢測(cè):應(yīng)用纖維蛋白凝膠行體外血管生成實(shí)驗(yàn)。96孔培養(yǎng)板每孔依次加30μl人纖維蛋白原與20μl凝血

5、酶,晃勻,37℃30min成凝膠;加入5×103細(xì)胞懸液培養(yǎng)過(guò)夜;去除培養(yǎng)液,依次加30μl人纖維蛋白原與20μl凝血酶,晃勻,加100μl培養(yǎng)液,24h。顯微鏡觀察血管生成,隨機(jī)選取3個(gè)視野(×200)計(jì)數(shù)血管數(shù)目。原代細(xì)胞培養(yǎng)至第4天時(shí),換用含不同濃度(10和50ng/ml)VEGF的M199培養(yǎng)液,培養(yǎng)1d后,運(yùn)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。將貼壁細(xì)胞用胰酶消化后,PBS反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液,2000r/min離心5min,將細(xì)胞置于5

6、0μlPBS中,制成單細(xì)胞懸液。加入CD31直標(biāo)抗體,4℃孵育60min。PBS洗滌重懸后立即在避光條件下進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè),計(jì)數(shù)1×104個(gè)細(xì)胞。同型對(duì)照一抗為PBS,其余操作同上。統(tǒng)計(jì)CD31+細(xì)胞的百分率,應(yīng)用WinMDI2.9軟件進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：
　　 培養(yǎng)7d的細(xì)胞CD133和CD34陽(yáng)性率分別為69.44％和81.0596。MTT實(shí)驗(yàn)顯示,10ng/ml組細(xì)胞的OD值明顯大于0ng/ml組和50ng/m

7、l組,0ng/ml組的OD值明顯大于50ng/ml組(P＜0.05);遷移實(shí)驗(yàn)、體外血管形成實(shí)驗(yàn)及誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)顯示,50ng/ml組和10ng/ml組較0ng/ml組更能促進(jìn)EPC的遷移、體外血管形成及誘導(dǎo)分化,且50ng/ml組強(qiáng)于10ng/ml組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 VEGF能夠提高EPC遷移能力、體外血管形成能力及促進(jìn)誘導(dǎo)分化,且隨著VEGF濃度的升高而增強(qiáng)。VEGF能夠提高EPC增殖能力,但隨著