遺傳性耳聾基因診斷新技術(shù)的研究和應(yīng)用與非綜合征性耳聾家系的分子遺傳學(xué)研究.pdf

1、全國性聾病分子流行病學(xué)研究數(shù)據(jù)顯示，盡管遺傳性耳聾具有廣泛的遺傳異質(zhì)性，但大多數(shù)非綜合征性遺傳性耳聾僅由為數(shù)不多的幾個(gè)基因突變所致，如GJB2基因、線粒體DNA基因、SLC26A4基因等，從而奠定了在中國開展耳聾基因診斷的理論基礎(chǔ)，同時(shí)也催生出新的耳聾整體預(yù)防思路和方法。本課題致力于通過設(shè)計(jì)經(jīng)濟(jì)、高效、快速、高通量適合中國國情的耳聾基因診斷方法，為建立標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的耳聾基因診斷、遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷模式提供技術(shù)支持，使耳聾基因組研究所取

2、得的偉大成果能夠被廣泛應(yīng)用于中國臨床遺傳性耳聾病因?qū)W診斷和聾兒出生缺陷防控的實(shí)踐，實(shí)現(xiàn)其“基礎(chǔ)-臨床”的順利轉(zhuǎn)化，從而推動(dòng)國內(nèi)臨床耳聾基因診斷、遺傳咨詢和基于耳聾基因診斷的產(chǎn)前診斷工作的廣泛開展，最終實(shí)現(xiàn)總體降低耳聾發(fā)生及出生缺陷的目標(biāo)。本課題另外一個(gè)重要內(nèi)容就是收集到湖南地區(qū)一個(gè)表現(xiàn)為X-連鎖或母系遺傳方式的遺傳性耳聾大家系，通過對(duì)這一家系的臨床特征及分子病因?qū)W研究，進(jìn)一步探討mtDNA突變同非綜合征耳聾之間的關(guān)系，并為進(jìn)行耳聾致病基

3、因的功能研究打下了基礎(chǔ)。本研究包括以下三個(gè)部分。
　　 第一部分運(yùn)用PE-DHPLC技術(shù)快速檢測(cè)中國人群非綜合征型耳聾熱點(diǎn)基因突變
　　 目的：建立針對(duì)中國人幾種常見的遺傳性耳聾基因型的基因診斷新方法。
　　 方法：PCR擴(kuò)增的靶序列，經(jīng)引物延伸，得到中國人非綜合征性耳聾6個(gè)常見突變的特異性延伸片段(GJB2-235delC、GJB2-299delAT、PDS IVS7-2A>G、PDS A2168G、mtDNA

4、A1555G、mtDNA C1494T)，用全變性高效液相色譜分析延伸片段混合物，分離圖譜可鑒定被檢樣本的基因型。
　　 結(jié)果：所選擇的120例散發(fā)非綜合征性耳聾樣品的引物延伸變性高效液相色譜與經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證在結(jié)果吻合，前來遺傳咨詢的4個(gè)小家系的引物延伸變性高效液相色譜與測(cè)序結(jié)果亦相吻合，該法的準(zhǔn)確率達(dá)100％。
　　 結(jié)論：該法是一種準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)非綜合征性耳聾基因突變的分析方法，可用于非綜合征性耳聾基因及其他遺傳疾病的

5、診斷及遺傳咨詢。
　　 第二部分基因芯片技術(shù)在散發(fā)非綜合征性耳聾基因診斷中的應(yīng)用
　　 第一章基因芯片技術(shù)應(yīng)用于耳聾基因檢測(cè)的可行性研究
　　 目的：分析基因芯片技術(shù)應(yīng)用于非綜合征性耳聾基因檢測(cè)的準(zhǔn)確性，為建立新的基因檢測(cè)方法提供依據(jù)。
　　 方法：通過對(duì)122例散發(fā)的非綜合征性耳聾患者進(jìn)行芯片及測(cè)序的雙盲檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證GJB2_235delC在這些散發(fā)樣本中的分布情況.
　　 結(jié)果：隨機(jī)選取的1

6、22例樣本的GJB2235delC的芯片檢測(cè)與測(cè)序結(jié)果基本吻合，該法的準(zhǔn)確率達(dá)89.9％。
　　 結(jié)論：該款芯片具有快速、高通量、高準(zhǔn)確性、等特點(diǎn)，適合于大樣本量遺傳性耳聾的基因檢測(cè)。
　　 第二章基因芯片檢測(cè)技術(shù)在散發(fā)非綜合征性耳聾患者中的應(yīng)用
　　 目的：應(yīng)用Goldengate耳聾基因芯片檢測(cè)散發(fā)非綜合征性耳聾患者，研究散發(fā)非綜合征性耳聾的熱點(diǎn)突變基因及耳聾基因位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析，為建立新的基因檢測(cè)方法提供依據(jù)

7、及模型。
　　 方法：對(duì)389例散發(fā)DNA樣本(其中正常人DNA樣本102例，散發(fā)非綜合征性耳聾患者的DNA樣本287例)進(jìn)行芯片檢測(cè)，應(yīng)用關(guān)聯(lián)分析研究耳聾及所選位點(diǎn)的相關(guān)性.
　　 結(jié)果：6個(gè)位點(diǎn)WFS1_Leu829Pro、GJB3_Arg32Trp、OTOF_IVS5+1、TMIE_IVS2_2、PCDH15_3_BP_DEL_5601_5603aac及SLC26A4_Gly497Ser與耳聾的關(guān)聯(lián)分析為負(fù)相關(guān)；r

8、s4809261、rs7421943、MYH14_Arg726Ser、TMPRSS3_PRO404LEU、rs878042、COCH_MET512THR、MY03A_IVS7_2、TMC1_Tyr259Cys、GJB2_Arg165Trp、rs10515535、rs568619、rs7600176、rs3664、WHRN_IVS2+1、rs4679155及COL9A3_9_BP_DEL_541_549ggtccccca與耳聾的關(guān)聯(lián)分析為

9、正相關(guān)。
　　 結(jié)論：基因芯片技術(shù)的建立及成功運(yùn)用是對(duì)聾病基因檢測(cè)手段的創(chuàng)新和突破，同時(shí)表明NSHL具有高度的遺傳異質(zhì)性。
　　 第三部分線粒體12SrRNA1555A>G突變?cè)谝粋€(gè)中國耳聾大家系的特殊表現(xiàn)及分析
　　 目的：線粒體突變是導(dǎo)致耳聾的重要原因，本文旨在探討線粒體基因組1555A>G突變?cè)谝粋€(gè)中國耳聾大家系的特殊表現(xiàn)及分析。
　　 方法收集一遺傳性耳聾大家系5代48人，提取樣品DNA后，首先采

10、用X-linkage連鎖分析，未發(fā)現(xiàn)變異，再采用DNA直接測(cè)序法對(duì)家系成員進(jìn)行線粒體全基因組、GJB2編碼區(qū)及POU3F4基因進(jìn)行序列分析。
　　 結(jié)果：經(jīng)過計(jì)算，連鎖分析所有位點(diǎn)LOD值結(jié)果均小于1，不支持連鎖；經(jīng)mtDNA基因組序列分析發(fā)現(xiàn)12 SrRNA基因A1555G突變是此家系的唯一致病突變，同時(shí)患者均攜帶一新的變異14163C>T。
　　 結(jié)論：線粒體A1555G兔變是本家系耳聾的主要原因，環(huán)境因素及氨基甙類