線粒體遺傳性耳聾核修飾因子的臨床及分子研究.pdf

1、第一章:母系遺傳線粒體性耳聾1555A＞G突變大家系臨床分子研究
　　線粒體DNA或編碼線粒體蛋白的核基因發(fā)生改變,導(dǎo)致氧化磷酸化異常,細(xì)胞不能產(chǎn)生足夠的ATP而導(dǎo)致細(xì)胞功能減退甚至壞死,即線粒體病。臨床表型的異質(zhì)性是線粒體疾病的典型特征,而表型的異質(zhì)性一直原因不清。線粒體1555A＞G突變是引起藥物性耳聾和非綜合性耳聾最常見(jiàn)的原因,攜帶此突變的家系呈現(xiàn)多變的臨床表型和不完全的外顯率,具體機(jī)制是不清楚和復(fù)雜的。我們對(duì)一個(gè)6代100

2、余人的中國(guó)大家系進(jìn)行了臨床、分子、閾值、核基因GJB2、TRMU以及線粒體單體型的分析,以期了解線粒體單體型、環(huán)境因素、核基因背景、線粒體1555A＞G突變拷貝數(shù)在此攜帶線粒體1555A＞G突變家系中的作用。在臨床聽(tīng)力評(píng)估中我們嘗試用高頻測(cè)聽(tīng)方法,發(fā)現(xiàn)沒(méi)有接觸氨基糖甙類藥物的家系成員聽(tīng)力圖呈現(xiàn)一定的規(guī)律性,聽(tīng)力損失最早出現(xiàn)在12kHZ,繼之聽(tīng)力損傷從超高頻12kHz延伸到高頻8kHz、4kHz。我們用焦磷酸測(cè)序檢測(cè)到同質(zhì)1555A＞G變

3、變和1555A＞G異質(zhì)突變,除一人攜帶異質(zhì)性1555A＞G突變外其余均為同質(zhì)性1555A＞G突變,1555A＞G變變的閾值和耳聾臨床表型無(wú)關(guān)。在核修飾基因GJB2檢測(cè)中,攜帶1555A＞G突變的母系成員中7人檢測(cè)到雜合的T123N,其中攜帶T123N和1555A＞G的母系成員中使用氨基糖甙類藥物者比未使用氨基糖甙類藥物者聽(tīng)力損失嚴(yán)重,未使用氨基糖甙類藥物者且同時(shí)攜帶T123N和1555A＞G的個(gè)體比只攜帶1555A＞G的個(gè)體聽(tīng)力損失更為

4、嚴(yán)重。核基因TRMU第一外顯子的檢測(cè)未見(jiàn)有意義突變A10S。此家系所有母系成員進(jìn)化樹(shù)分析為線粒體單體型B4C1C,有趣的是和一個(gè)以前已報(bào)道的中國(guó)家系同屬于單體型B4C1C,當(dāng)氨基糖甙類藥物作用計(jì)算在內(nèi)時(shí),兩家系的外顯率分別是63.6％和5.9％,去除氨基糖甙類藥物作用的影響,外顯率分別是51.5％和0％。雖然兩個(gè)中國(guó)家系分享同樣的單體型并且同樣缺乏可能提高外顯率的功能性二級(jí)突變,卻呈現(xiàn)出完全不同的外顯率。試驗(yàn)結(jié)果提示該家系耳聾的高外顯率

5、和單體型B4C1C、1555A＞G變變閾值關(guān)系并不密切,因此我們推測(cè)此家系較高的外顯率起主要作用的是環(huán)境和/或核修飾基因。氨基糖甙類藥物和其他未知的核基因可能是決定性因素。
　　第二章:核基因TFB1M、TRMU對(duì)耳蝸線粒體及毛細(xì)胞的作用機(jī)制
　　研究背景:母系遺傳線粒體耳聾是遺傳性耳聾的一種,但是精確的線粒體缺失導(dǎo)致組織特異性的耳聾的病理機(jī)制目前不清。最常見(jiàn)的線粒體耳聾是A1555G突變,臨床異質(zhì)性一直是研究A1555G突

6、變的難點(diǎn)。核基因可能是線粒體耳聾A1555G突變的臨床表型的修飾因子。尋找線粒體A1555G突變的核修飾基因最理想的方法就是研究具有相同A1555G突變但臨床表型不同的家系成員的耳蝸細(xì)胞表達(dá)差異。因?yàn)闊o(wú)法獲取耳蝸組織,所以采用早期的家系連鎖分析方法,定位TTRMU、MT01、TFB1M、GTPBp3這四個(gè)核基因和線粒體RNA修飾有關(guān)。而mtTFB1M和線粒體耳聾綜合癥的潛在的關(guān)系被注意是因?yàn)樵贙sgA缺乏的大腸桿菌株表達(dá)h-mtTFB1

7、后可以恢復(fù)16S莖環(huán)的甲基化和對(duì)氨基糖甙類藥物(春雷霉素)的敏感性。TFBM、TFAM、mtRNA聚合酶是哺乳動(dòng)物線粒體轉(zhuǎn)錄機(jī)制核心組成部分,在線粒體生物合成中起著至關(guān)重要的作用。TFBM由核基因編碼轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體。有研究發(fā)現(xiàn)A1555G突變同TFB1M過(guò)表達(dá)相似,可以導(dǎo)致12SrRNA超甲基化,導(dǎo)致相同的有缺陷的逆向線粒體合成信號(hào),誘導(dǎo)對(duì)壓力改變易凋亡的易感細(xì)胞。而線粒體12srRNA的甲基化是維持哺乳動(dòng)物核糖體必需的,12SrRNA甲

8、基化有可能是以前未認(rèn)識(shí)到的線粒體合成的異常信號(hào)。鑒于沒(méi)有一個(gè)真正意義的具有類似A1555G線粒體DNA突變的老鼠模型,因此設(shè)想觀察新霉素誘導(dǎo)下小鼠核基因TFB1、TRMU、耳蝸線粒體、毛細(xì)胞凋亡的相互關(guān)系。即外源化合物作用于耳蝸毛細(xì)胞,細(xì)胞核、線粒體基因是否會(huì)發(fā)生交互作用,導(dǎo)致耳聾/毛細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展。
　　研究目的:線粒體核修飾基因TFB1M、TRMU與正常耳蝸毛細(xì)胞和新霉素致?lián)p的耳蝸毛細(xì)胞和線粒體的作用機(jī)制。
　　研

9、究方法:1、采用新生1-2天小鼠聽(tīng)覺(jué)上皮體外無(wú)血清培養(yǎng)模型,建立新霉素致?lián)p模型。2、活細(xì)胞動(dòng)態(tài)檢測(cè)線粒體膜電位的變化,了解線粒體的功能。3、檢測(cè)基因TFB1M、TRMU在聽(tīng)覺(jué)上皮細(xì)胞核和線粒體中的表達(dá)以及部分凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:在新霉素致?lián)p4小時(shí)后,盡管基底膜中圈外毛細(xì)胞形態(tài)完整,但是已經(jīng)出現(xiàn)線粒體膜電位的改變;新霉素致?lián)p4小時(shí)洗脫后3小時(shí),線粒體底圈、中圈膜電位消失,在底圈、中圈出現(xiàn)散在死亡的毛細(xì)胞,底圈較中圈多,頂

10、圈未見(jiàn)死亡細(xì)胞。新霉素致?lián)p12小時(shí)線粒體底圈、中圈大量毛細(xì)胞缺失,并導(dǎo)致膜電位明顯降低;24小時(shí)線粒體膜電位完全消失,caspase9、caspase8表達(dá)高。新霉素致?lián)p12小時(shí),耳蝸聽(tīng)覺(jué)上皮細(xì)胞線粒體以及核內(nèi)的TFB1M表達(dá)上調(diào),在此時(shí)間點(diǎn)同時(shí)出現(xiàn)線粒體膜電位的改變、外毛細(xì)胞大量消失。新霉素致?lián)p24小時(shí)洗脫后48小時(shí)出現(xiàn)caspase7、caspase9、caspase8高表達(dá),caspase3、XIAP低表達(dá)。聽(tīng)覺(jué)上皮細(xì)胞核內(nèi)TFB

11、1M蛋白的表達(dá)稍低,TRMU的表達(dá)在兩組無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:1、新霉素致?lián)p小鼠基底膜洗脫期的凋亡途徑可能存在線粒體之外的其他途徑。2、在新霉素致?lián)p洗脫期,RNA修飾基因TRMU和RNA甲基轉(zhuǎn)移酶TFB1M表達(dá)無(wú)明顯改變。3、在新霉素致?lián)p12小時(shí),細(xì)胞核內(nèi)基因TFB1M蛋白質(zhì)水平的表達(dá)上調(diào),并且和線粒體膜電位消失、外毛細(xì)胞大量丟失共存。TFB1M蛋白質(zhì)水平的表達(dá)上調(diào)可能導(dǎo)致12SrRNA超甲基化,繼而影響毛細(xì)胞凋亡和線粒體功能喪