慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾抑制骨橋蛋白表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾抑制骨橋蛋白表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響姓名：孫冰生申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：欽倫秀20070408博士論文 中文摘要慢病毒介導(dǎo)的R N A 干擾抑制骨橋蛋白表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響中文摘要肝細(xì)胞肝癌( 簡(jiǎn)稱肝癌) 是世界上最常見(jiàn)、惡性度最高的腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第6 位、死因的第3 位，在我國(guó)已成為惡性腫瘤的第2 位死因。近幾十年來(lái)盡管對(duì)肝癌的基礎(chǔ)研究和診斷

2、治療都取的了顯著進(jìn)步，但肝癌的總體預(yù)后仍然很差，并沒(méi)有顯著的改善，5 年生存率僅為5 ％左右。手術(shù)治療仍是目前肝癌最有效的方法，但肝癌根治性切除后5 年轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率高達(dá)6 0 - 7 0 0 ．4 ，其遠(yuǎn)期療效仍欠滿意。術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)已成為進(jìn)一步提高肝癌療效的主要障礙，臨床上迫切需要尋找能預(yù)測(cè)肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的分子和新的干預(yù)治療方法。骨橋蛋白( O s t e o p o n t i n , o P N ) 是一種分泌型的磷酸化糖蛋白，可與整合

3、素和C D 4 4 結(jié)合，參與腫瘤細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程，許多研究顯示其參與多種惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。我們前期與美國(guó)國(guó)立癌癥研究所合作，應(yīng)用e D N A a r r a y s 技術(shù)在全基因組范圍內(nèi)比較4 0 例不伴與伴有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的肝癌之間、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶和原發(fā)瘤之間基因表達(dá)譜的變化，經(jīng)細(xì)胞及組織表達(dá)水平分析，證實(shí)O P N 表達(dá)升高與肝癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，應(yīng)用O P N 抗體阻斷其作用可抑制肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。后期研究我們還發(fā)現(xiàn)肝癌患者外周血

4、O P N 表達(dá)水平與術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及病人的預(yù)后有關(guān)，提示O P N 可作為肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)指標(biāo)和治療靶點(diǎn)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。為此，本課題采用目前國(guó)際上較先進(jìn)的R N A 干擾技術(shù)一慢病毒介導(dǎo)的m i c r o R N A ( m i R N A ) 干擾，抑制O P N 表達(dá)并構(gòu)建穩(wěn)定的O P N 表達(dá)沉默肝癌細(xì)胞株，通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)觀察O P N 沉默對(duì)肝癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響，并探討其相關(guān)機(jī)制。第一部分慢病毒R N

5、 A i 載體的構(gòu)建本部分的研究目的是構(gòu)建慢病毒R N A i 表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染人高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株H C C L M 3 ( 原位接種5 周后肺轉(zhuǎn)移率為l o o ％，皮下接種5 周后肺轉(zhuǎn)移率達(dá)1 0 0 ％) ，并篩選、獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。方法：首先體外化學(xué)合成O P N 序列特異性p r e ．m i R N h X 嘆鏈( O P N i ．1 、O P N i ．2 、O P N i 一3 、O P N i - 4 )