RMP的回復(fù)對人肝癌細胞SMMC-7721生物學(xué)特性的影響.pdf

1、目的：
　　 為進一步研究研究RMP(RPB5—mediating protein)功能制備其多克隆抗體，并通過脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染方法回復(fù)穩(wěn)定干擾細胞株中RMP的表達，研究RMP對人肝癌細胞SMMC—7721生物學(xué)特性的影響。
　　 方法：
　　 1．RMP多克隆抗體的制備。
　　 2．Western blot檢測所制備的多克隆抗體特異性。
　　 3．采用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染法分別將真核表達質(zhì)粒pFLAG—

2、CMV—4—RMP及空載體pFLAG—CMV—4轉(zhuǎn)入穩(wěn)定干擾RMP的肝癌細胞株。利用RT—PCR和Westernblot檢測目的基因在各細胞株中RNA及蛋白的表達。
　　 4．MTT法檢測各細胞株的增殖變化。
　　 5．MTT法檢測各細胞株的黏附能力。
　　 6．體外劃痕實驗檢測細胞遷移能力。
　　 7．Transwell檢測各細胞株的侵襲能力。
　　 8．經(jīng)60Coγ射線輻照后，流式細胞術(shù)檢測相

3、應(yīng)時間點各細胞株周期及凋亡的變化。
　　 9．RT—PCR法檢測與細胞周期和凋亡相關(guān)基因的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1．通過SDS—PAGE法確定含有RMP蛋白短突變體GST—D1相比GST—D3、GST—D5、GST—D9和GST—D10表達量最高，所制備的多克隆抗體具有最高的抗原抗體反應(yīng)性，純化融合蛋白后免疫新西蘭大白兔獲得抗血清，WesternBlot顯示抗體具有一定的特異性。
　　 2．脂質(zhì)體介

4、導(dǎo)的過表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染干擾細胞株，經(jīng)RT—PCR及Western blot確認了RMP在穩(wěn)定干擾細胞株中回復(fù)表達。
　　 3．通過MTT法繪制細胞生長曲線，結(jié)果顯示RMP可以促進SMMC—7721細胞生長，同時降低細胞的粘附能力。
　　 4．劃痕實驗結(jié)果顯示RMP可促使細胞的遷移能力增加。
　　 5．Transwell結(jié)果顯示RMP促進細胞侵襲能力增加。
　　 6．經(jīng)60Coγ射線誘導(dǎo)后，流式細胞術(shù)檢測細

5、胞周期和凋亡，隨著時間點推移，與對照組相比G2期阻滯逐漸降低，細胞凋亡減少。
　　 7．RT—PCR方法檢測顯示促凋亡基因Bax和Caspase3表達下調(diào)，凋亡抑制基因Bcl—2表達上調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 本研究在原核表達系統(tǒng)中成功表達和純化了GST融合蛋白，制備了RMP多克隆抗體并成功用于Western Blot。RMP能夠促進肝癌細胞SMMC—7721的生長，降低細胞的黏附能力、促進細胞的遷移并提高細胞的