姜黃素納米粒(NanoCurcTM)聯(lián)合索拉非尼對(duì)肝細(xì)胞癌生物學(xué)特性的協(xié)同作用及機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌發(fā)病率位列全世界第五、我國第三的惡性腫瘤。根據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)，在2030年前，肝癌都將保持持續(xù)增長(zhǎng)，其病死率更是高居第二位[1]。近幾年，腫瘤治療雖然取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，諸如手術(shù)、介入、肝移植等方法的采用，但肝癌總體5年生存率仍僅15％[2，3]。超過60％的肝癌患者在初次就診時(shí)已經(jīng)進(jìn)入中晚期并伴有轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，從而失去手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。因此，抗腫瘤藥物的研究顯得極為重要，成為進(jìn)一步提高肝癌生存率的關(guān)鍵。
　　腫瘤的發(fā)生發(fā)展、

2、侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的復(fù)雜動(dòng)態(tài)過程?；瘜W(xué)治療因其自身優(yōu)點(diǎn)受到越來越多的重視，對(duì)抗腫瘤轉(zhuǎn)移效果好且副作用小藥物的需求更是不斷增加。越來越多的研究將目光投向天然產(chǎn)物。天然產(chǎn)物已經(jīng)成為抗癌藥物的重要來源，約70％抗腫瘤藥物提取自天然產(chǎn)物[4]。此外，聯(lián)合用藥方案具有提高抗腫瘤療效、延緩耐藥性的產(chǎn)生，而毒性增加不多的優(yōu)點(diǎn)，為抗腫瘤提供了新的對(duì)策。
　　本研究主要探討姜黃素納米粒(NanoCurcTM，NC)聯(lián)合索拉非尼對(duì)肝細(xì)胞癌生物學(xué)特性

3、的影響。采用體外細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（CCK-8），體外劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)NC聯(lián)合索拉非尼對(duì)人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、遷移、侵襲能力的影響。隨后應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析對(duì)細(xì)胞周期、凋亡的作用。建立MHCCLM3-RFP裸鼠皮下成瘤和原位成瘤模型并觀察NC聯(lián)合索拉非尼對(duì)腫瘤大小、肺轉(zhuǎn)移率的影響。最后探討NC和/索拉非尼抗腫瘤效應(yīng)的可能機(jī)制，為防治肝癌提供新的可能藥物。
　　第一部分 NC聯(lián)合索拉非尼對(duì)人肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的

4、影響
　　本研究旨在通過肝癌細(xì)胞系Huh7和MHCCLM3體外實(shí)驗(yàn)，探索NC和／或索拉非尼對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、侵襲以及細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)行為的影響。
　　利用NC和/或索拉非尼藥物對(duì)Huh7和MHCCLM3細(xì)胞系進(jìn)行處理。隨后采用體外細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（CCK-8）檢測(cè)NC和/或索拉非尼處理前后細(xì)胞增殖能力的變化;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移能力的變化;Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的改變。進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)分析

5、對(duì)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響。
　　結(jié)果顯示，NC和/或索拉非尼處理后，肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力都顯著降低，且NC和/或索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞增殖遷移抑制能力相似（P＜0.01）。然而，NC和索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的抑制作用顯著優(yōu)于NC或索拉非尼單獨(dú)處理后(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)相一致，NC和/或索拉非尼可顯著升高肝癌細(xì)胞早、晚期凋亡及壞死細(xì)胞比例，而NC和索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用對(duì)壞死細(xì)胞增高程度顯

6、著優(yōu)于NC或索拉非尼單獨(dú)處理后。與NC或索拉非尼單獨(dú)處理相比，聯(lián)合處理后G2/M期細(xì)胞比例顯著增高(P＜0.01)。
　　以上結(jié)果表明，NC聯(lián)合索拉非尼能夠協(xié)同抑制肝癌細(xì)胞增殖，降低遷移和侵襲能力，增加細(xì)胞早、晚期凋亡及壞死比例。對(duì)細(xì)胞的抑制增殖作用與G2/M期阻滯相關(guān)。
　　第二部分 NC聯(lián)合索拉非尼對(duì)肝癌裸鼠模型生物學(xué)特性的影響
　　本研究旨在通過建立肝癌原位和皮下小鼠模型，探索NC和/或索拉非尼在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對(duì)腫瘤

7、細(xì)胞生長(zhǎng)以及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響。
　　通過建立人高轉(zhuǎn)移MHCCLM3-RFP皮下和原位移植瘤模型，研究NC和/或索拉非尼給藥與否對(duì)腫瘤大小的影響。獲取新鮮肺組織，通過熒光成像顯微鏡觀察肺組織中的轉(zhuǎn)移灶（轉(zhuǎn)移灶為標(biāo)記RFP的腫瘤組織），并通過H&E染色確定肺轉(zhuǎn)移情況。
　　結(jié)果顯示，4周后NC組、索拉非尼組、聯(lián)合組和對(duì)照組(給予PBS)的原位腫瘤大小有顯著性差異，分別為(0.75±0.14) cm3 vs(0.50±0.1

8、1)cm3 vs(0.45±0.09) cm3 vs(1.26±0.13) cm3;肺轉(zhuǎn)移率分別為50.0％，66.7％，16.7％，100％。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，NC和索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用能夠抑制肝癌生長(zhǎng)，減少肺轉(zhuǎn)移的數(shù)目。
　　第三部分 NC聯(lián)合索拉非尼對(duì)肝細(xì)胞癌生物學(xué)特性影響機(jī)制的研究
　　為了探討NC聯(lián)合索拉非尼抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的內(nèi)在機(jī)制，本研究從信號(hào)通路和肝癌干細(xì)胞兩方面入手。一方面，NC與索拉非尼聯(lián)

9、合應(yīng)用可協(xié)同抑制ERK磷酸化，減少NF-kB/p65 DNA結(jié)合，從而下調(diào)MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。另一方面，NC與索拉非尼聯(lián)合也能協(xié)同抑制肝癌干細(xì)胞——CD133+肝癌細(xì)胞的數(shù)量。
　　首先對(duì)Huh7及MHCCLM3細(xì)胞系進(jìn)行研究，借助RT-PCR、ELISA、Westernblot從蛋白質(zhì)、RNA層面對(duì)ERK1/2/NF-kB/MMP9信號(hào)通路進(jìn)行了檢測(cè)，并使用MMP-9抑制劑TIMP-1加以驗(yàn)證。其次借助R

10、T-PCR、ELISA、Western blot及免疫組化染色在裸鼠肝癌組織中再次進(jìn)行上述檢測(cè)。最后采用細(xì)胞流式技術(shù)對(duì)體外CD133+的肝癌細(xì)胞進(jìn)行定量分析研究，采用免疫組化染色對(duì)裸鼠肝癌組織中CD133指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。
　　上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在體內(nèi)及體外中，NC聯(lián)合索拉非尼均可使ERK1/2的磷酸化程度明顯降低，NF-kB/p65 DNA結(jié)合減少，最終導(dǎo)致MMP-9的表達(dá)下調(diào)，提示兩藥聯(lián)合可能通過該信號(hào)通路協(xié)同對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵