TGF-β-,1-siRNA對肝星狀細(xì)胞生物學(xué)活性影響的實驗研究.pdf

1、目的 肝纖維化是各種肝損傷的共同結(jié)果，肝星狀細(xì)胞(HSC)是肝纖維化形成的細(xì)胞基礎(chǔ)，許多細(xì)胞因子參與了肝纖維化和肝硬化的形成，，分子機理表明，在許多細(xì)胞因子參與中，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)在HSC的激活、細(xì)胞外基質(zhì)的聚積起著非常關(guān)鍵的作用，RNA干擾(RNAi)是一種能達(dá)到特異性抑制目的基因表達(dá)的現(xiàn)象，已成功地下調(diào)了一些內(nèi)源性基因的表達(dá)。我們目的是通過構(gòu)建表達(dá)TGF-β1小干擾RNA(siRNAs)的psu6TGF質(zhì)粒，觀察其在

2、肝星狀細(xì)胞中對HSC的信號激活和膠原的影響。 方法(1)從NCBI網(wǎng)站獲得大鼠TGF-βl的cDNA序列，根據(jù)Ambion公司網(wǎng)上設(shè)計軟件設(shè)計三個siRNA作用靶點，相應(yīng)的雙鏈DNA被插入pSilencer2.1-U6質(zhì)粒中，即，siTGFA、siTGFB、 siTGFC；(2)以脂質(zhì)體Metafectene2000轉(zhuǎn)染含熒光素基因(GFP)的質(zhì)粒于HSC-T6細(xì)胞中，觀察轉(zhuǎn)染效率：(3)為了得到高效沉默TGF-βlsiRNA

3、，利用脂質(zhì)體Metafectene2000將各組siRNA lug，2ug，4ug，6ug，8ug轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞，觀察沉默效果。然后，將最佳沉默siRNA導(dǎo)入HSC-T6細(xì)胞，分別在1，3，5天提取細(xì)胞mRNA和蛋白，并收集上清液；(4)RT-PCR檢測TGF-β1，I，III型膠原，smad3、smad7的mRNA表達(dá)；(5)West-Blot檢測TGF-β1和a-SMA的蛋白表達(dá)；(6)放射免疫法測細(xì)胞上清液透明質(zhì)酸、III型

4、前膠原、IV型前膠原含量變化；(7)免疫組化檢測I型用膠原蛋白表達(dá)結(jié)果；(1)表達(dá)針對TGF-βlsiRNA的質(zhì)粒是成功構(gòu)建的;(2)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA效率達(dá)70％：(3)6ug siRNA為最佳劑量，siTGFA、siTGFB、 siTGFC，對TGF-βImRNA的抑制率分別為60％、68％、O％；和West-Blot檢測TGF-β1蛋白表達(dá)結(jié)果基本一致：(4)轉(zhuǎn)染6ugsiTGFB 1，3，5天后， smad3、smad7的

5、mRNA下調(diào)分別為0％、61％、70％和O％、15％、16％；a-SMh的蛋白表達(dá)下調(diào)分別為O％、69％、78％；I，III mRNA型膠原下調(diào)分別為O％、59％、66％和O％、55％、60％；I型膠原蛋白表達(dá)明顯減少；上清液透明質(zhì)酸、III型前膠原、IV型前膠原含量分別為O％、55％±5％、65％±9％，O％、42％±5％、55％±7％和O％、40％±3％、42％±3％ ；(5)三個時間點測定結(jié)果均顯示，3d和5d與1d之間均存在顯

6、著性差異(P<0.01)，3d和5d差異不明顯(P<0.05)；(6)siRNA的干擾有效時間可持續(xù)10天左右。 結(jié)論；(1)篩選出的高效沉默TGF-βlsiRNA能明顯抑制TGF-β1的mRNA和蛋白表達(dá)：(2)高效沉默TGF-βlsiRNA能夠下調(diào)HSC激活信號：(3)高效沉默TGF-βl siRNA能夠減少HSC的膠原合成：(4)抑制作用呈劑量依賴性和序列特異性：(5)TGF-βl siRNA可望成為的治療肝纖維化的手段。