人DC-SIGN基因RNAi慢病毒載體的構建及功能學鑒定.pdf

1、樹突狀細胞特異性細胞間黏附分子-3-結合非整合素（dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule3 grabbingnonintergrin，DC-SIGN）是樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）表面的一種新型凝集素受體[1]，在調節(jié)樹突狀細胞黏附、遷移，激活初始T淋巴細胞，啟動免疫應答，以及病原體的免疫逃逸等多方面發(fā)揮重要作用[2-6]，是結核病干預策略中

2、的新靶標。DC-SIGN是DCs表面結核桿菌的主要受體。結核桿菌可通過其胞壁成分一帶甘露糖帽的脂阿拉伯甘露聚糖（mannose-capped lipoarabinomannan，ManLAM）與DC-SIGN分子結合，抑制DCs成熟[7-10]。DCs在抗結核免疫應答中發(fā)揮著中心作用，它是唯一能激活初始T細胞，啟動初始免疫應答的抗原提呈細胞[6，8]。而DCs要發(fā)揮活化初始T細胞的作用，其前提是必須成熟。RNA干擾（RNA interf

3、erence，RNAi）是一種可高效、特異地下調目標基因的表達并在基因功能研究和基因治療領域有著廣闊的應用前景的技術[11，12]。慢病毒表達載體是RNAi常用的載體之一，能將自身攜帶的片斷整合入宿主細胞基因組，在哺乳動物各類細胞穩(wěn)定表達小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），長期抑制基因表達[13]。
　　 本研究根據(jù)人DC-SIGN基因的mRNA序列選擇4條靶序列，設計合成雙鏈DNA，并經(jīng)

4、PCR擴增、DNA測序以及外源性篩選，確定RNAi有效靶序列，構建并包裝產(chǎn)生人DC-SIGN基因RNAi慢病毒表達載體。利用構建成功RNAi慢病毒表達載體轉染人外周血單核細胞誘導分化而來的DCs，通過流式細胞儀、RT-PCR以及Western blot檢測DCs表面DC-SIGN分子表達水平變化，流式細胞儀檢測DCs表面成熟標志物HLA-DR及CD86水平，ELISA檢測DCs培養(yǎng)上清液中IL-12、IL-10分泌水平，混合淋巴細胞反應

5、檢測DCs刺激T淋巴細胞增殖的能力。通過以上研究以明確慢病毒表達載體介導的RNA干擾對DCs表面DC-SIGN分子表達水平的抑制程度以及對DCs成熟度和功能的影響。
　　 研究結果：PCR擴增和DNA測序結果證實，DC-SIGN核苷酸鏈序列插入正確，外源性篩選確定兩條有效靶序列。選擇其中一條有效靶序列包裝慢病毒，產(chǎn)生濃縮慢病毒懸液的滴度為1×109TU/mL。利用人DC-SIGN基因RNAi慢病毒表達載體轉染DCs，流式細胞術、

6、PCR及WB檢測均提示DCs表面DC-SIGN表達水平降低，流式細胞儀顯示各組間成熟標志物HLA-DR及CD86差異無統(tǒng)計學意義，ELISA結果顯示各組DCs培養(yǎng)上清液中IL-10、IL-12水平差異無統(tǒng)計學意義，混合淋巴細胞反應結果顯示各組DCs誘導CD4+T淋巴細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學意義。
　　 研究結論：本研究建立了一種穩(wěn)定、有效的轉染人外周血單核細胞來源的DCs的方法，并能在體外細胞水平有效抑制DC-SIGN表達，慢病