食管鱗癌酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組學分析及MYH9 SiRNA對食管鱗癌細胞生物學行為的影響.pdf

1、背景及目的：食管癌的死亡率在我國惡性腫瘤中居第四位，超過90％的食管癌患者是鱗狀細胞癌。由于大多數(shù)食管癌患者就診時已處于晚期，因此采用手術(shù)切除為主的綜合治療，其5年生存率仍然很低。研究表明，酪氨酸激酶信號通路在多種腫瘤中表達異常，但是由于酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)在組織中的豐度很低，目前尚無對食管鱗癌及癌旁正常食管組織(簡稱癌旁組織，下同)進行酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組學的研究。本實驗采用新的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組分析方法，對食管鱗癌及癌旁組織進行差異

2、性酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組學研究，為揭示酪氨酸激酶信號通路在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用提供依據(jù)，同時為食管鱗癌的治療及早期診斷研究開辟新的思路。
　　 方法：
　　 在第一章中我們收集了28對食管鱗癌及癌旁組織標本，采用酪氨酸磷酸化抗體免疫沉淀富集酪氨酸磷酸化多肽，并用LTQ Orbitrap質(zhì)譜儀進行鑒定，將鑒定結(jié)果導入Genepattern軟件進行分析，篩選出差異明顯的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)，其中酪氨酸磷酸化差異最為明顯的M

3、YH9(編碼NMⅡA蛋白)，其與DDR1關(guān)系密切。
　　 在第二章中我們提取了MYH9磷酸化水平最高的10例食管鱗癌組織基因組DNA，經(jīng)PCR和測序檢測了MYH9基因是否存在相關(guān)位點突變，western blot驗證了NMⅡA蛋白在28對食管鱗癌和癌旁組織中的表達差異，采用免疫組織化學的方法研究了50例食管鱗癌組織和30例癌旁組織中NMⅡ A和DDR1的表達，并與臨床病理資料進行相關(guān)性分析。
　　 在第三章中我們檢測了3

4、株食管鱗癌細胞株KYSE-140、KYSE-150、KYSE-510的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)譜，比較了人食管鱗癌組織和鱗癌細胞株酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)表達的差異，同時為第四章進行NMⅡ A蛋白的功能學研究提供細胞依據(jù)。
　　 在第四章中，我們應用SiRNA沉默MYH9基因，qRT-PCR和westernblot檢測SiRNA對NMⅡ A蛋白的沉默水平，細胞計數(shù)明確NMⅡ A蛋白沉默對細胞增殖能力的影響，細胞粘附實驗檢測NMⅡ A蛋白沉默

5、對細胞粘附能力的影響，劃痕試驗和transwell實驗評價NMⅡ A蛋白沉默對細胞的平面和3-D遷移能力的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.在28對食管鱗癌及癌旁組織中共檢測到1037種差異性酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)，其中有477種在鱗癌組織中上調(diào)，560種在癌旁組織中上調(diào)。在腫瘤組織中酪氨酸磷酸化水平最高的是MYH9，palladin，APP，DDR1，K105種蛋白，在癌旁組織中酪氨酸磷酸化水平最高的是K23，K20，Sci

6、ellin，envoplakin，EphA15種蛋白。食管鱗癌及癌旁組織中總體酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)無明顯差異。MYH9的酪氨酸磷酸化位點是Tyr754和Tyr1408。經(jīng)相關(guān)分析，MYH9與DDR1的關(guān)系密切。
　　 2.測序結(jié)果顯示MYH9基因的1，10，16,24-26,30-32,35—39等14個外顯子沒有檢測到常見突變位點。Western blot檢測表明NMⅡ A蛋白在28對腫瘤組織中的表達高于癌旁組織。免疫組化顯示，

7、NMⅡ A蛋白在所有的食管鱗癌組織中表達，顯著高于癌旁組織(100％ VS26.7％，P=0.000)，其中強陽性表達25例(50％)，NMⅡ A的強陽性表達與腫瘤的侵潤深度無關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)、組織學分級相關(guān)，隨著轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)個數(shù)增加，NMⅡA強陽性表達率明顯增加(P=0.015<0.05)，低分化組病例的強陽性表達率也顯著高于高分化組(P=0.018<0.05)；DDR1蛋白在腫瘤組織中陽性率顯著高于癌旁組織中的陽性率(86％ VS

8、30％，P=0.000)，DDR1的表達僅與腫瘤的侵潤深度有關(guān)(P=0.027<0.05)，與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)個數(shù)和腫瘤組織分化程度無關(guān)。
　　 3.食管鱗癌細胞株中的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)類型和磷酸化水平與鱗癌組織中的磷酸化類型和水平存在明顯差異；在3株食管鱗癌細胞株中，只有KYSE-510發(fā)生了動力/收縮蛋白的酪氨酸磷酸化，并且磷酸化的動力/收縮蛋白只有KLC2，MYH9和dnnactin2三種。三株細胞株中均有NMⅡ A蛋白的表達，

9、KYSE-140的表達相對較低。
　　 4.Western blot檢測結(jié)果顯示基因沉默效率在72h SiRNA/轉(zhuǎn)染試劑比例為75ng/1.5ul時最高，qRT-PCR檢測提示MYH9 mRNA被SiRNA沉默了89.9％，應用MYH9 SiRNA沉默KYSE-510細胞NMⅡ A蛋白表達后，與陰性轉(zhuǎn)染組相比，細胞的增殖速度減慢，體外粘附實驗顯示細胞的粘附能力增強，細胞的平面和3-D遷移能力降低(P<0.01)。
　　

10、 結(jié)論：
　　 1.應用PhosphoScan技術(shù)對食管鱗癌及癌旁組織進行了酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組學分析，篩選出了多個在食管鱗癌中酪氨酸磷酸化異常增高的蛋白質(zhì)，最明顯的是動力/收縮蛋白NMⅡ A和受體型酪氨酸激酶DDR1：
　　 2.食管鱗癌組織中NMⅡ A的高酪氨酸磷酸化可能不是由MYH9基因突變引起，而是與組織中NMⅡ A蛋白的表達量增高有關(guān)；
　　 3.食管鱗癌組織中NMⅡA的高表達與食管鱗癌組織的分化和轉(zhuǎn)移