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文檔簡介
1、生物傳感技術由于具有分析時間短、成本較低、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點,極大的推動了分析化學在生命科學領域的應用。熒光生物傳感技術因其無需分離、操作簡單、可進行原位測定、分析成本低等優(yōu)點而備受關,目前,已廣泛用于核酸、蛋白質、生物活性小分子、病毒等的分析檢測。納米材料具有獨特的光學和電化學性質,為構建生物傳感方法提供了新的思路。近年來,核酸介導的信號放大方法為高靈敏生物檢測提供了重要的技術支持,在各類生物分子的檢測中得到了廣泛應用?;虻男?/p>
2、飾過程與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切關系,而基因修飾受到各種核酸修飾酶的協(xié)同調控。因此,建立核酸修飾酶活性檢測的新方法新技術,在癌癥等重大疾病的早期診斷與治療,以及癌癥發(fā)病機理研究中具有重要意義。
本論文將納米材料和核酸信號放大技術應用于熒光生物傳感構建,發(fā)展了三種熒光生物檢測體系,分別用于Dam甲基轉移酶、堿基切除修復酶等酶活性測定。具體研究內容如下:
1.發(fā)展了一種基于氧化石墨烯和T7核酸外切酶輔助循環(huán)信號放大的熒光方
3、法用于DNA甲基轉移酶(MTase)的活性檢測和抑制劑篩選。研究中使用Dam甲基轉移酶作為模型分析物。在Dam甲基轉移酶存在時,發(fā)夾結構DNA底物探針被甲基化,然后被DpnⅠ核酸限制性內切酶識別并進行切割,釋放出單鏈DNA片段。隨后釋放的單鏈DNA與FAM熒光團標記的信號探針(DP探針)雜交。在形成的雜交體中,DP探針的5'端為鈍末端,而被釋放的單鏈DNA5'端多出4個堿基。此時,T7核酸外切酶能夠對雜交體中DP探針進行降解并釋放出單鏈
4、DNA。釋放的單鏈DNA引發(fā)下一輪的雜交-降解循環(huán)。最終大量的FAM熒光團從DP探針5'端釋放。由于較低的親和力,釋放的FAM不能被吸附到氧化石墨烯表面,熒光信號被保留。相反,在沒有Dam甲基轉移酶存在時,DP探針可被氧化石墨烯吸附,導致熒光猝滅。將T7核酸外切酶高效的降解能力與氧化石墨烯超強的熒光猝滅效率相結合,從而獲得較大的信號背景比,提高了Dam甲基轉移酶活性測定的靈敏度。并且該方法不需要設計特定的酶識別位點,也不需要進行熒光團/
5、淬滅團的雙標記,使得實驗設計簡單,成本低廉。此外,該方法也適用于Dam甲基轉移酶抑制劑的測定。
2.構建了一種基于二硫化鎢納米片及核酸外切酶Ⅲ共輔助信號增強策略的DNA糖基化酶熒光偏振檢測方法。在本工作中,我們以尿吡啶DNA糖基化酶(UDG)和8-氧代鳥嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)為研究模型。底物探針HP頸部含受損的堿基,在DNA糖基化酶存在情況下會切除受損的堿基,此時HP熔鏈溫度降低,并且打開。打開后的HP會與FAM標記
6、的單鏈DNA(DP)雜交,在雜交體中,DP的3'端是凹末端,ExoⅢ會對雜交體中DP進行消化,通過DP不斷的雜交與釋放過程,大量的FAM被釋放,釋放的FAM不會吸附到WS2納米片表面,熒光偏振信號值很小。沒有DNA糖基化酶活時,DP與HP不會雜交,因此ExoⅢ不會降解DP。單鏈DP能夠吸附到WS2納米片表面,質量變大,偏振增強。結合WS2納米片和ExoⅢ共同輔助信號放大作用,可實現(xiàn)對DNA糖基化酶的高靈敏測定。此外,該方法也實現(xiàn)了對細胞
7、粗提取物中UDG活性測定。并實現(xiàn)對UDG活性的抑制試驗。最后,該方法設計簡單,易于操作,選擇性好,有望用于DNA糖基化酶相關機制研究和疾病診斷中。
3.利用SGⅠ作為熒光信號分子,基于核酸外切酶Ⅰ(ExonucleaseⅠ,ExoⅠ)的信號放大構建了一種簡單、經濟、高靈敏的熒光方法用于UDG活性檢測。本工作中,以莖部區(qū)域含有四個尿嘧啶堿基的發(fā)夾探針(HP)作為UDG的底物。在沒有UDG存在時,SGⅠ染料可以與HP結合,熒光大大
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