基于切刻內(nèi)切酶的核酸信號放大技術(shù)用于蛋白及DNA修飾酶的熒光檢測.pdf

1、對特定核酸序列進行擴增，是分子生物學(xué)中的一項基本技術(shù)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，以及生物化學(xué)、生物物理學(xué)等交叉學(xué)科在分子生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，涌現(xiàn)了許多新的核酸擴增技術(shù)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、滾環(huán)擴增技術(shù)(RCA)、鏈置換放大技術(shù)(SDA)等。
　　基于核酸切刻內(nèi)切酶的核酸放大方法最為一種新型的鏈置換放大技術(shù)已經(jīng)被越來越多的研究者所關(guān)注。該方法主要建立在核酸切刻內(nèi)切酶以DNA雙鏈為識別序列，但只切割其中的一條單鏈的特殊功能上。該

2、放大方法的原理是，在核酸切刻內(nèi)切酶切刻形成的裂口處，通過聚合酶的作用以dNTPs為原料從裂口處的3’端聚合延伸，置換出等位的DNA鏈，由此又形成了新的完整的含有切刻酶識別位點的DNA序列。這條雙鏈再次被核酸切刻內(nèi)切酶識別切割，進而開始“聚合-切刻”的循環(huán)，產(chǎn)生大量被置換下來的DNA單鏈。最后通過其他信號轉(zhuǎn)換方式進行信號檢測。該方法通過聚合-切刻循環(huán)，可以顯著增強檢測信號。
　　基于上述方法，綜合文獻(xiàn)報道，本論文主要利用核酸切刻內(nèi)切

3、酶信號放大技術(shù)用于免疫分析以及對一些重要DNA修飾酶進行熒光檢測，主要內(nèi)容如下：
　　(1)發(fā)展了一種基于核酸切刻內(nèi)切酶核酸信號放大技術(shù)的免疫分析方法。該方法以人IgG為檢測模型，首先利用酶聯(lián)免疫技術(shù)的傳統(tǒng)方法依次將羊抗人IgG抗體、人IgG和生物素標(biāo)記的抗體固定在聚苯乙烯微孔板上，形成免疫夾心結(jié)構(gòu)。然后通過生物素與親和素的特異性結(jié)合反應(yīng)，利用鏈霉親和素將生物素標(biāo)記的抗體和生物素修飾的引物探針鏈接起來，之后通過引物探針與模板雜交，

4、并在聚合酶和核酸切刻內(nèi)切酶的共同作用下進行切刻內(nèi)切酶核酸信號放大反應(yīng)。最后將核酸放大后的寡核苷酸單鏈與分子信標(biāo)雜交，從而通過檢測熒光來測定目標(biāo)抗原的濃度。該方法將傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫技術(shù)與新型的切刻內(nèi)切酶核酸信號放大技術(shù)結(jié)合起來，具有高效，靈敏度高等優(yōu)點，其檢測下限大0.1ng/mL。
　　(2)基于切刻內(nèi)切酶核酸信號放大技術(shù)，開發(fā)了一種對磷酸酶檢測的方法。該方法以T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)為研究模型，對其DNA3’端磷酸酶活性

5、進行監(jiān)測。利用一條3’端帶有磷酸基團且具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針，通過T4 PNK將其3’端磷酸基團修復(fù)成羥基，觸發(fā)DNA聚合酶聚合延伸，從而啟動切刻內(nèi)切酶核酸信號放大。經(jīng)過切刻循環(huán)放大產(chǎn)生的大量單鏈DNA與分子信標(biāo)雜交，打開分子信標(biāo)產(chǎn)生熒光信號。通過熒光信號的強度對T4 PNK的磷酸酶活性其進行定量檢測。該方法操作便捷，靈敏度高，其檢測下限達(dá)到0.167U/mL。
　　(3)基于核酸切刻內(nèi)切酶信號放大技術(shù)，提出了一種對糖基化酶進行非標(biāo)記

6、熒光檢測的方法。該方法以尿嘧啶DNA-糖基化酶(UDG)為檢測模型。通過一條DNA單鏈與另一條含有尿嘧啶堿基和切刻內(nèi)切酶識別位點的發(fā)卡狀底物探針部分雜交，形成的雙鏈DNA作為UDG作用的底物。由于UDG的作用，尿嘧啶堿基從DNA骨架上移除，從而使得雙鏈底物探針的解鏈溫度降低，在實驗條件下解鏈。釋放出的底物探針3’端形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，在DNA聚合酶、切刻內(nèi)切酶以及dNTPs的共同作用下觸發(fā)切刻內(nèi)切酶核酸信號放大過程。核酸放大過程產(chǎn)生大量的富鳥

7、嘌呤DNA單鏈，在K+的輔助作用下形成G-四螺旋結(jié)構(gòu)，通過N-甲基卟啉二丙酸IX染料(N-Methyl mesoporphyrin IX，NMM)嵌入G-四螺旋結(jié)構(gòu)產(chǎn)生熒光信號。該方法將糖基化酶的識別過程與切刻內(nèi)切酶核酸信號放大技術(shù)有效地結(jié)合起來，并將G-四螺旋結(jié)構(gòu)與對其有特異性的NMM染料結(jié)合，從而增強NMM熒光的方法引入該實驗，顯著地增強了檢測靈敏度。發(fā)展的這種非標(biāo)記熒光手段操作方便，可以高效、靈敏度的用于UDG的測定，其檢測下限為