輪狀病毒分子流行病學(xué)調(diào)查及NSP486-175原核表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建.pdf

1、目的：
　　 了解我院兒童腹瀉標(biāo)本中輪狀病毒(Rotavirus，RV)分離株G血清型和P基因型的流行特點(diǎn)，并對(duì)RV的三種檢測方法：膠體金法、RT-PCR法和PAGE法進(jìn)行方法學(xué)的比較；應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，將編碼輪狀病毒NSP4蛋白86-175位氨基酸的基因片段克隆入PGEX-4T-1載體，為后續(xù)蛋白表達(dá)奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1．收集2007年5月～2010年4月因腹瀉癥狀就診兒童的資料及糞便標(biāo)本998

2、0份，經(jīng)膠體金法篩檢A群輪狀病毒抗原陽性標(biāo)本，對(duì)其送檢來源及各科室的RV-AG陽性檢出率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；留取其中2009年11月～2010年4月輪狀病毒抗原陽性、≤5歲住院腹瀉患兒標(biāo)本153份，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，巢式-聚合酶鏈反應(yīng)(Nest-PCR)法，對(duì)VP7、VP4基因分型。
　　 2．收集2009年11月～2009年12月腹瀉患兒送檢標(biāo)本，分別進(jìn)行膠體金法、RT-PCR法和PAGE法檢測RV-AG，計(jì)

3、算各種方法的陽性檢出率，用SPSS軟件進(jìn)行x2分割法分析。計(jì)算特異度、靈敏度、正確率和Youden指數(shù)(YI)來評(píng)價(jià)三種檢測方法的準(zhǔn)確度。
　　 3．隨機(jī)抽取G血清型和P基因型分型結(jié)果為G3P[8]型RNA樣本5份，采用RT-PCR擴(kuò)增NSP4基因全長并測序，BLAST比對(duì)后，Nest-PCR擴(kuò)增編碼NSP4蛋白第86-175位氨基酸的基因，經(jīng)純化回收后，將其克隆入pMD18-Tsimplevector中構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-

4、T-NSP486-175，并用BamHI和SalI雙酶切該重組質(zhì)粒并測序，純化并回收酶切后得到的288bp片段，將其克隆至原核表達(dá)載體PGEX-4T-1的BamHI/SalⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒PGEX-4T-1-NSP486-175，轉(zhuǎn)化感受態(tài)受體菌E.coliDH5α，，用雙酶切鑒定并測序。
　　 結(jié)果：
　　 1.2007年5月～2010年4月期間，膠體金法檢測兒童腹瀉糞便標(biāo)本9980例，RV-AG陽性標(biāo)本3544例

5、，其陽性率為35.51％；男孩RV-AG檢出率為25.44％(590/2319)，女孩RV-AG檢出率為26.12％(279/1068)，性別檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.178，P=0.673)，各月齡組檢出率以6-12月齡組最高，達(dá)30.44％；門急診和住院患兒RV-AG檢出率分別為32.02％(357/1115)和35.95％％(3187/8865)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)送檢來源進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，送檢標(biāo)本大多數(shù)來自A07兒內(nèi)消化病

6、區(qū)(25％，2451/9980)，B03兒童綜合病區(qū)(17％，1727/9980)和A03兒童感染病區(qū)(12％，1227/9980)，除A09兒內(nèi)腎病病區(qū)、D19新生兒ICU和D20新生兒病區(qū)外，其余科室三年間RV-AG陽性檢出率均無明顯變化，D20于2010年4月27～30日出現(xiàn)RV院感爆發(fā)流行。
　　 2．留取的2009年11月～2010年4月輪狀病毒抗原陽性、55歲住院腹瀉患兒153份標(biāo)本中，G3型79份(51.63％)，

7、G1型40份(26.14％)，G1G3型20份(13.07％)，G2G3型3份(1.96％)，G未分型11份(7.19％)：P[8]型104份(67.97％)，P[4]型3份(1.96％)，P[8]P[4]型1份(0.65％)，P未分型45份(29.41％)，G血清型和P基因型的組合以G3P[8]為主，占33.33％(51/153)。
　　 3.2009年11月～2009年12月共收集腹瀉患兒送檢標(biāo)本129份，分別經(jīng)膠體金法、R

8、T-PCR法和PAGE法檢測，陽性率分別為24.80％(32/129)，11.63％(15/129)，26.36％(34/129)，經(jīng)x2分割法，按α＇=0.0125水準(zhǔn)，PAGE法和膠體金法、RT-PCR法的檢出率均有差別，而膠體金法和RT-PCR法檢出率無顯著差異。以PAGE法為檢測輪狀病毒的最終標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算膠體金法和RT-PCR法的靈敏度為93.33％和100％、特異度為84.21％和83.33％、正確率同為85.27％，以及YI為

9、0.7754和0.8333，說明RT-PCR法的準(zhǔn)確度更高。
　　 4．RT-PCR法擴(kuò)增出770bp的NSP4全長基因，測序并BLAST比對(duì)后與Nov08-3404株同源性達(dá)99％，Nest-PCR擴(kuò)增編碼NSP4蛋白第86-175位氨基酸的基因得到大小為288bp片段，經(jīng)純化回收后，將其克隆入pMD18-Tsimplevector中構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-NSP486-175，并用BamHI和SalⅠ雙酶切該重組質(zhì)粒并測

10、序，結(jié)果顯示無突變。重組質(zhì)粒PGEX-4T-1-NSP486-175經(jīng)BamHI和SalⅠ雙酶切并測序，酶切后電泳顯示分別在300bp左右和5000bp左右出現(xiàn)明顯條帶，表明PGEX-4T-1-NSP486-175原核表達(dá)構(gòu)建成功。
　　 結(jié)論：
　　 我院A群輪狀病毒以G3型為主，其次為G1型，P基因型以P[8]型為主，未檢測出其他型別，發(fā)病年齡以6～12月齡組最高。對(duì)膠體金、RT-PCR和PAGE法進(jìn)行了方法學(xué)比較，