黃芪甲苷對鎘致大鼠睪丸支持細(xì)胞損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的:探討鎘對大鼠原代培養(yǎng)睪丸支持細(xì)胞的細(xì)胞生長活性、超微結(jié)構(gòu)、相關(guān)蛋白表達(dá)和信號分子的影響,以及黃芪甲苷的拮抗作用和可能機(jī)制。
　　 方法:采用18天齡清潔級健康SD雄性大鼠,無菌操作取出大鼠睪丸,再剪碎,依次用0.25％胰蛋白酶、0.05%V型膠原酶進(jìn)行消化,制成單細(xì)胞懸液,培養(yǎng)24小時,再經(jīng)Tris-Hcl處理后,得到純度近95%的支持細(xì)胞?？瞻讓φ战M、0.5%二甲基亞砜(DMSO)組、鎘(50μmol/L)組、鎘(50μ

2、mol/L)加黃芪甲苷(分別為5、10、20mg/L)組的培養(yǎng)支持細(xì)胞用于四甲基偶氮唑鹽(MTT)細(xì)胞生長活性實(shí)驗(yàn),其中DMSO組用于驗(yàn)證0.5%DMSO溶劑是否對細(xì)胞有毒害作用;鎘(50μmol/L)加不同濃度黃芪甲苷組用于篩選最佳保護(hù)作用的黃芪甲苷濃度?？瞻讓φ战M、鎘組、鎘加最佳濃度黃芪甲苷組的培養(yǎng)細(xì)胞分別再用于超微結(jié)構(gòu)觀察、波形蛋白和E-鈣粘連蛋白/β-環(huán)連蛋白免疫組織化學(xué)及信號傳導(dǎo)分子磷酸化p38MAPK(P-p38MAPK)的

3、檢測。
　　 結(jié)果:電鏡下正常原代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)特征:細(xì)胞多呈不規(guī)則形,細(xì)胞膜向外形成較多突起,核不規(guī)則、核被膜常有高度返折,核內(nèi)常染色質(zhì)豐富,異染色質(zhì)較少,多位于核膜內(nèi)側(cè),核仁明顯,可數(shù)個,胞質(zhì)內(nèi)線粒體、高爾基復(fù)合體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器豐富,局部胞質(zhì)區(qū)域可見明顯微絲聚集,符合大鼠睪丸支持細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)。24h和48h MTT細(xì)胞生長活性顯示空白對照與DMSO組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,鎘組較空白對照組細(xì)胞活性明顯減弱,鎘加黃芪甲苷(10mg/

4、L)組保護(hù)作用最佳,其中24h時鎘加黃芪甲苷(10mg/L)組的細(xì)胞活性雖低于對照組但明顯高于鎘組;48h時鎘加黃芪甲苷各組的細(xì)胞活性均高于鎘組。鎘處理后,支持細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變表現(xiàn)為:線粒體內(nèi)室腫脹,溶酶體增多,核旁多量脂滴堆積,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不同程度擴(kuò)張或形成不規(guī)則的大空泡,髓樣結(jié)構(gòu)形成。部分損害嚴(yán)重的細(xì)胞可見整個細(xì)胞胞質(zhì)電子密度降低,細(xì)胞器崩解,細(xì)胞核染色質(zhì)邊集、凝聚或核溶解。此外有少許支持細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,可見凋亡小體形成;鎘加黃芪甲苷(

5、10mg/L)處理組支持細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷改變較鎘組為輕。波形蛋白、E-鈣粘連蛋白和β-環(huán)連蛋白免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:對照組,波形蛋白呈棕黃色陽性反應(yīng),密集環(huán)繞于細(xì)胞核周圍形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),少數(shù)可見棕黃色陽性產(chǎn)物貫穿細(xì)胞核。鎘處理后胞質(zhì)內(nèi)陽性反應(yīng)產(chǎn)物表達(dá)較對照組明顯減弱,稀疏分布于細(xì)胞核周圍。黃芪甲苷組胞質(zhì)內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物表達(dá)雖較對照組減弱,但較鎘組表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05);E-鈣粘連蛋白和β-環(huán)連蛋白的結(jié)果與波形蛋白表達(dá)結(jié)果相似。P-p38M

6、APK檢測結(jié)果顯示:對照組P-p38MAPK陽性產(chǎn)物呈棕色,稀疏分布于胞質(zhì)或核周。鎘處理后陽性產(chǎn)物表達(dá)明顯增強(qiáng),且分布位置有向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的趨勢,核內(nèi)亦可見棕色陽性產(chǎn)物。鎘加黃芪甲苷(10mg/L)組陽性產(chǎn)物雖較對照組增多但明顯少于鎘組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:鎘可以導(dǎo)致原代培養(yǎng)大鼠睪丸支持細(xì)胞的細(xì)胞生長活性受抑制,細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷,細(xì)胞骨架蛋白及粘連蛋白(波形蛋白、E-鈣粘連蛋白和β-環(huán)連蛋白)表達(dá)下降,并使信號傳導(dǎo)分子(