東方鱟脂多糖結(jié)合蛋白和小鼠抗菌肽的基因克隆、表達(dá)及生物學(xué)功能研究.pdf

1、本文首次將FC基因在Tn細(xì)胞中成功地進(jìn)行了表達(dá),通過(guò)體外LPS中和活性及抑菌活性測(cè)定,證明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的生物學(xué)活性.FC在Tn中表達(dá)不形成包涵體,易純化,活性損失小.利用親和層析柱純化重組表達(dá)的FC,得到純化的蛋白質(zhì)為180ug/l,純度達(dá)到94﹪.之后,為了深入了解FC中的不同結(jié)構(gòu)域?qū)ζ渖锘钚缘挠绊?我們除了表達(dá)了FC全長(zhǎng)片段外,還在Tn細(xì)胞中表達(dá)了FC的四個(gè)截短的片段CES123L,CES123, S123L 和S123,并比

2、較了這五個(gè)肽的體外抑菌活性及LPS結(jié)合活性.我們構(gòu)建了PGEX-4T-2- Bin1b大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒,并成功地在大腸桿菌中表達(dá)出GST-Bin1b融合蛋白質(zhì).GST-Bin1b 融合蛋白經(jīng)thrombin酶切后,產(chǎn)生了N端融合了thrombin酶切位點(diǎn)的氨基酸的Bin1b 肽,而不是N端為豆蔻酰化的甘氨酸的Bin1b 肽, 這個(gè)結(jié)果為我們研究N端豆蔻酰化的甘氨酸是否為Bin1b肽抑菌活性所必需提供了條件.抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)由GST-Bin1

3、b 融合蛋白水解的到的Bin1b肽能夠顯著抑制細(xì)菌的生長(zhǎng),這個(gè)結(jié)果表明N端豆蔻?；母拾彼釋?duì)于Bin1b 的抑菌活性不是必需的,這為通過(guò)基因工程手段獲得大量的Bin1b生物活性肽奠定了基礎(chǔ).Bin1b在大腸桿菌中的表達(dá)量不高,僅為1.3mg/l.還不能達(dá)到大量生產(chǎn)的要求.為了能夠獲得大量的Bin1b蛋白質(zhì),我們嘗試在大腸桿菌中表達(dá)Bin1b的串聯(lián)產(chǎn)物.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明串聯(lián)兩個(gè)Bin1b單元的融合體能夠成功地在大腸桿菌中獲得表達(dá),2×Bin1