東北林蛙皮抗菌肽及其生物學(xué)特性.pdf

1、抗菌肽(antinucrobial peptides)是廣泛存在于生物界中的一類生物活性肽，由10-50個(gè)氨基酸構(gòu)成?？咕木哂邢鄬?duì)分子量低、水溶性好、低抗原性和熱穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，多數(shù)抗菌肽具有抗細(xì)菌或真菌的作用，有些還具有抗原蟲、病毒或腫瘤細(xì)胞的功能，并對(duì)動(dòng)物體內(nèi)的正常細(xì)胞影響較小。此外，由于抗菌肽是通過干擾原核細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)導(dǎo)致質(zhì)膜通透性增大，從而引起抑菌或殺菌作用，病原體不易對(duì)其產(chǎn)生抗藥性，這使其成為新一代抑菌藥物的首選研究對(duì)象。新的

2、抗菌肽的鑒定及生物學(xué)特性研究可為新型抗生素的研發(fā)及設(shè)計(jì)提供分子模板。 兩棲類動(dòng)物是從水生魚類演化到真正陸地生的爬行類動(dòng)物之間的過渡類群，它們皮膚裸露、濕潤，無疑給外界微生物的侵入提供了便利條件，因此在長期的進(jìn)化歷程中，它們的皮膚中演化形成了一套有效的抵御微生物侵襲的防御系統(tǒng)——抗菌肽。為開拓和適應(yīng)廣闊的棲息地及多樣的生態(tài)條件，相對(duì)于其他生物組織而言，兩棲類動(dòng)物皮膚含有數(shù)量和種類更多的抗菌肽，是天然抗菌肽巨大的資源庫。蛙科(Ran

3、idae)動(dòng)物是分布最廣泛的兩棲動(dòng)物，幾乎遍及各大洲，占據(jù)著不同的生態(tài)地位，它們皮膚抗菌肽在種類和數(shù)量等方面，都是極其驚人的。 東北林蛙(Rana dybowskii)為主要分布在我國東北長白山脈的重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，我們的前期工作研究表明，東北林蛙皮分泌物由多種組分組成，其皮膚分泌物抗菌肽粗提物具有廣譜的抗菌活性，但其具體成分、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、生物學(xué)特性尚不清楚。為系統(tǒng)認(rèn)識(shí)和了解東北林蛙皮抗菌肽特點(diǎn)，本文根據(jù)兩棲類抗菌肽的保守氨基酸序列設(shè)

4、計(jì)簡并引物，以東北林蛙皮cDNA文庫為模板，采用PCR方法克隆并測定了抗菌肽cDNA基因。同時(shí)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對(duì)東北林蛙皮分泌物進(jìn)行了分析，鑒定東北林蛙皮抗菌肽分子。對(duì)部分東北林蛙抗菌肽進(jìn)行人工合成或真核細(xì)胞表達(dá)，并對(duì)其結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能等進(jìn)行分析。 方法： 一、東北林蛙皮抗菌肽鑒定及分子多樣性 1.東北林蛙皮抗菌肽cDNA克隆及序列分析 在GenBank中選取已報(bào)道的蛙類抗菌肽mRNA序列，經(jīng)CLUSTALW

5、多序列對(duì)比(http：//www．Ebi．Ac．uk/clustalw/)，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)林蛙抗菌肽基因cDNA的5’端簡并引物：5’—ATG TTC ACC(A/T) TG AAG AAA—3’。以3’端多聚A為模板，設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄引物：5’—CTG ATC TAG AGG TAC CGG ATC CTT TTT TTT TTT TTT TTT T—3’。調(diào)取抗菌肽基因，連接pMD19-T載體，克隆測序。測得的序列遞交NCBI網(wǎng)站進(jìn)行同

6、源性分析和氨基酸序列分析。 2.東北林蛙皮抗菌肽質(zhì)譜測序 以溫和電擊方法，刺激東北林蛙背部皮膚，獲得皮膚分泌物，冷凍干燥，進(jìn)行電噴霧電離/質(zhì)譜/質(zhì)譜(ESI—MS/MS)分析及序列測定。 3.東北林蛙皮抗菌肽基本性質(zhì)的生物信息學(xué)分析 利用ExpasyProtParam在線分析軟件，計(jì)算抗菌肽理論分子量、等電點(diǎn)。并依據(jù)Kyte and Doolittle方法計(jì)算平均疏水值(grand average hyd

7、ropathy，GRAVY)。 二、東北林蛙皮抗菌肽結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特性 1.抗菌肽人工合成 以wang和Rink amidate—MBHA樹脂為載體，采用對(duì)Fmoc或Boc作為α氨基的保護(hù)基，人工固相合成法合成東北林蛙抗菌肽。SephadexTM G—15柱層析純化合成肽，RP—HPLC和電噴射離子質(zhì)譜(ESI—MS)檢測。 2.東北林蛙抗菌肽的結(jié)構(gòu)分析 抗菌肽二級(jí)結(jié)構(gòu)采用ExPASy系統(tǒng)中提供的神

8、經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測方法(HNN)進(jìn)行預(yù)測。預(yù)測二級(jí)結(jié)構(gòu)為α—螺旋的抗菌肽序列利用Antheprot release5.0進(jìn)行螺旋輪(Helical wheel)預(yù)測，非α—螺旋抗菌肽利用ProBuider(http：//nova．colombo58.unimi．It/probuilder．Htm)把序列轉(zhuǎn)換為*．Pdb文件，進(jìn)行蛋白的1D到3D的轉(zhuǎn)換，使用VMD顯示，分析氨基酸分布。 以50％三氟乙醇/PBS溶液擬膜，利用圓二色技術(shù)測定

9、合成肽在PBS和50％三氟乙醇/PBS溶液中CD光譜，分析二級(jí)結(jié)構(gòu)。 3.抑菌活性和最小抑菌濃度 利用瓊脂平板法檢測抗菌肽抑菌活性，采用微量稀釋法測定最小抑菌濃度。 4.溶血活性分析 微量溶血試驗(yàn)、血平板法測定抗菌肽溶血活性。 5.穩(wěn)定性 分別將抗菌肽用以下方法處理：0.25％胰酶37℃消化1小時(shí)；反復(fù)凍融3次；煮沸5分鐘；煮沸30分鐘。處理后的抗菌肽利用菌落計(jì)數(shù)法檢測活性。 三、

10、東北林蛙皮新型抗菌肽dybowskin—2CDYa表達(dá)、活性及結(jié)構(gòu) 1.重疊延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR，SOE PCR)擴(kuò)增dybowskin—2CDYa基因 根據(jù)巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)偏愛密碼子、dybowskin—2CDYa成熟肽cDNA序列，設(shè)計(jì)合成引物Zα15'CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCCGCT

11、GTTGGTAGACACGGTAGAAGATTCGG3’、Zα25'CTAGTCTA GAAATCATCAGTGCTTTCTGTGCTTTCTCAAACCGAATCTTCTGGAGTGTC3’、Zα115'CCGCTCGAGAAAAGAGAG3’和Zα9K5'CGGAATTCCTAGTCTAGAAATCATCAGT3’，添加XhoⅠ、XbaⅠ酶切位點(diǎn)。利用SOE PCR獲取dybowskin—2CDYa全長基因。 2.重組質(zhì)粒構(gòu)

12、建 電泳回收dybowskin—2CDYa片段，限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切pPICZαA和dybowskin—2CDYa片段，T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109，篩選得到的陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，并對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行分析。 3.dybowskin—2CDYa在畢赤酵母中表達(dá) SacⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行單酶切線性化，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，陽性轉(zhuǎn)化子搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)。發(fā)酵上清液的抑菌活性檢測、RT-PC

13、R mRNA水平檢測，液相色譜和質(zhì)譜檢測目的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。 4.蛋白含量測定 用BCA法測定發(fā)酵液上清的總蛋白濃度，計(jì)算重組抗菌肽含量。 5.表達(dá)產(chǎn)物純化及活性分析 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮上清液，濃縮液經(jīng)凝膠過濾層析、RP—HPLC純化，獲得重組蛋白。利用瓊脂平板法檢測抗菌肽抑菌活性。血平板法測定抗菌肽溶血活性。 6.dybowskin—CDYa結(jié)構(gòu)分析 抗菌肽二級(jí)結(jié)構(gòu)采用ExPASy系統(tǒng)中提供的

14、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測方法HNN進(jìn)行預(yù)測。利用Antheprot release5.0進(jìn)行螺旋輪預(yù)測。 以50％三氟乙醇/PBS溶液擬膜，利用圓二色技術(shù)測定dybowskin—CDYa在PBS和50％三氟乙醇/PBS溶液中CD光譜，分析二級(jí)結(jié)構(gòu)。 結(jié)論： 1.一只東北林蛙個(gè)體可以同時(shí)編碼表達(dá)至少14種抗菌肽，與其它蛙類抗菌肽相同，它們的信號(hào)肽和前導(dǎo)肽十分保，成熟肽高度變異。除已報(bào)道的抗菌肽家族外，還存在結(jié)構(gòu)新、抗菌強(qiáng)及低溶

15、血活性的新型抗菌肽。 2.東北林蛙皮抗菌肽由13～33個(gè)氨基酸殘基組成，多為堿性多肽，等電點(diǎn)大于8，帶正電荷。除dybowskin—1CDYa外，東北林蛙抗菌肽以α—螺旋結(jié)構(gòu)為主。 3.人工合成東北林蛙皮抗菌肽對(duì)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌有不同程度抗菌活性，其中dybowskin—1 CDYa抑菌活性較強(qiáng)，最小抑菌濃度分別為6μg/ml和3μg/ml，同時(shí)dybowskin—1CDYa具有低溶血活性

16、，半數(shù)溶血值大于450μg/ml。 4.東北林蛙皮抗菌肽具有較好的穩(wěn)定性，在煮沸和反復(fù)凍融條件下仍保留抗菌活性，但其對(duì)胰酶敏感。 5.利用巴斯德畢赤酵母GS115表達(dá)體系能夠正確表達(dá)得到東北林蛙皮抗菌肽dybowskin—2CDYa。目的多肽的表達(dá)量約為0.83 mg/mL。 6.表達(dá)得到的dybowskin—2CDYa對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有抗菌活性和低溶血活性。Dybowskin—2CDYa親水環(huán)境以α