兩種樹脂基質(zhì)復(fù)合材料對人牙齦成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的：研究ENAMIC彈性瓷、Ceramage聚合瓷兩種修復(fù)材料對人牙齦成纖維細(xì)胞黏附、增殖、蛋白合成以及基因表達(dá)等生物學(xué)行為的影響，了解它們的生物相容性，為種植冠修復(fù)材料選擇提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1、實驗分組
　　將ENAMIC、Ceramage、純鈦片三種材料分為EN、Ce、Ti三組；將含10％ FBS的DMEM培養(yǎng)液作為陰性對照組（Nc組）；將含0.64%苯酚、10%FBS的DMEM培養(yǎng)液作為陽性對照組

2、（Pc組）。
　　Ceramage經(jīng)堆朔光照固化制作成12x10x1.5mm大小試件30枚。將ENAMIC和純鈦片切割、打磨為12x10x1.5 mm大小試件各30枚。90枚試件依次用不同粒度耐水砂紙打磨，使試件最終大小為10x8x1mm。
　　將EN、Ce、Ti三組試件超聲清洗、干燥、滅菌，各組取3枚試件用于觀察人牙齦成纖維細(xì)胞黏附，剩余27枚試件用于制備浸提液，按照表面積/浸提液體積為3cm2/mL的標(biāo)準(zhǔn)，將試件置于含有

3、10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中,(37士1)0C浸提(72士2)h，并用0.22μM的過濾器將浸提液過濾備用。
　　2、人牙齦成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
　　通過牙齦組織塊培養(yǎng)的方法獲取并純化人牙齦成纖維細(xì)胞（human gingival fabroblasts，HGFs）；通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色（波形絲蛋白、角蛋白染色）的方法鑒別HGFs的來源，結(jié)合取材部位及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察確定細(xì)胞是否為HGFs；通過原代細(xì)胞傳代培養(yǎng)獲取實驗所

4、需細(xì)胞；通過細(xì)胞計數(shù)的方法，繪制HGFs生長曲線，了解HGFs的增殖規(guī)律。
　　3、EN、Ce、Ti三組試件周圍HGFs黏附情況觀察
　　EN、Ce、Ti組分別取3枚試件與第4代HGFs共培養(yǎng)3天，顯微鏡下觀察三組試件周圍細(xì)胞黏附情況，以Nc組培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞為對照，比較細(xì)胞黏附情況。
　　4、EN、Ce、Ti三組材料浸提液對HGFs增殖的影響
　　將HGFs接種在EN、Ti、Ce三組材料浸提液、Pc組及Nc組培養(yǎng)

5、液中，培養(yǎng)1、3、5、7天，通過噻唑藍(lán)（MTT）法測定各組細(xì)胞增殖情況。
　　5、EN、Ce、Ti三組材料細(xì)胞毒性評價
　　通過計算各組細(xì)胞相對增殖率（RGR），將RGR轉(zhuǎn)換為0-4級毒性級別，評價三組材料的細(xì)胞毒性。
　　6、EN、Ce、Ti三組材料浸提液對HGFs表達(dá)I型膠原蛋白、纖維粘連蛋白基因mRAN的影響
　　HGFs在EN、Ce、Ti三組材料浸提液、Nc組培養(yǎng)液中培養(yǎng)3天,通過RT-qPCR檢測HGF

6、s I型膠原蛋白（COL-I）、纖維粘連蛋白（Fn）基因mRAN表達(dá)的情況。
　　7、EN、Ce、Ti三組材料浸提液對HGFs合成和分泌I型膠原蛋白的影響
　　HGFs在EN、Ti、Ce三組材料浸提液、Nc組培養(yǎng)液中培養(yǎng)1、3天，收集培養(yǎng)液，提取上清液，ELISA法檢測上清液中I型膠原蛋白的含量。
　　結(jié)果：
　　1、HGFs的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果
　　組織塊培養(yǎng)第5天時有原代細(xì)胞從組織塊周圍爬出，第15天時細(xì)胞

7、爬滿瓶底的2/3。HGFs呈長梭形或星形，可有數(shù)目不等、長短不一的胞質(zhì)突，呈典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。細(xì)胞呈排列條索狀、放射狀或漩渦狀。
　　免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示HGFs抗波形絲蛋白染色陽性，細(xì)胞質(zhì)中陽性染色顆粒呈棕黃色，分布均勻，細(xì)胞核清晰、無染色；抗角蛋白染色陰性，說明細(xì)胞為中胚層來源。結(jié)合取材部位，可以證明培養(yǎng)獲得的細(xì)胞為
　　HGFs。HGFs生長曲線呈“S”形，即經(jīng)歷緩慢生長期、對數(shù)生長期、平臺期。
　　2、H

8、GFs在EN、Ce、Ti三組材料試件周圍黏附情況
　　HGFs在EN、Ce、Ti組材料試件周圍生長與在Nc組中生長狀況相似，HGFs生長良好，細(xì)胞形態(tài)呈長梭形、星形，細(xì)胞排列呈條索狀、旋渦狀。3、HGFs的增殖情況
　　EN、Ce、Ti三組吸光度值從第1天到第7天逐漸升高，與Nc組吸光度變化規(guī)律一致。各時段 HGFs增殖情況：EN、Ce、Ti組均低于Nc組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；EN、Ce、Ti組間差異無統(tǒng)計學(xué)意

9、義（P＞0.05）；EN、Ce、Ti、Nc四組均顯大于Pc組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4、三組材料細(xì)胞毒性評價情況
　　HGFs相對增殖率（RGR）：在各時段，EN、Ce、Ti組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在各時段，EN、Ce、Ti三組均顯著大于Pc組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。毒性級別評估顯示：在各時段，EN、Ce、Ti三組毒性級別均為1級，1級為無毒性；Pc組毒性級別均為4級，4級為重度毒

10、性。
　　5、HGFs COL-I、Fn基因mRNA表達(dá)的情況
　　與Nc組比較，EN、Ce和Ti組COL-I、Fn基因相對表達(dá)量均下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；EN、Ce、Ti組間COL-I、Fn基因mRNA相對表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　6、HGFs COL-I合成和分泌的情況
　　COL-I含量：各時段，EN、Ce、Ti、Nc四組之間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。