Dkk調(diào)節(jié)Wnt信號通路的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ).pdf

1、Wnt信號通路在胚胎發(fā)育、細胞極化產(chǎn)生和細胞命運分化等過程中發(fā)揮重要作用。Wnt信號異常也與包括癌癥在內(nèi)的許多疾病密切相關(guān)。規(guī)范型Wnt通路的活化需要Wnt蛋白與受體Fz蛋白和共受體LRP5/6同時結(jié)合。Dkk蛋白是規(guī)范型Wnt信號通路的拮抗劑,對于胚胎細胞命運和骨的形成非常關(guān)鍵。Dkk蛋白含有兩個特征性的富含半胱氨酸的亞基,分別稱為N端半胱氨酸富含亞基和C端半胱氨酸富含亞基。Dkk通過C端半胱氨酸富含亞基與LRP5/6胞外β螺旋槳結(jié)構(gòu)

2、域相互作用從而抑制規(guī)范型Wnt信號通路；Dkk N端半胱氨酸富含亞基不與LRP5/6結(jié)合,對C端亞基起調(diào)節(jié)作用。然而,Dkk與LRP5/6相互作用的結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)還不清楚。在此研究論文中,我們利用核磁共振譜學(xué)方法解析了小鼠Dkk2的N端和C端半胱氨酸富含亞基(分別稱為Dkk2C和Dkk2N)的三維結(jié)構(gòu),并研究了Dkk2C與LRP5/6胞外β螺旋槳結(jié)構(gòu)域相互作用的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)。 首先,為了有效的制備重組Dkk2C和Dkk2N蛋白,

3、我們構(gòu)建了硫氧還蛋白(Trx)-Dkk2C/Dkk2N融合表達載體,使其在Origami B菌株中高效表達。我們利用鎳柱親和層析和HPLC方法純化Dkk2C和Dkk2N蛋白,得到了折疊并具有正確生物活性的蛋白。由此,我們建立了一種從大腸桿菌中有效表達并純化富含雙硫鍵的蛋白的方法。 我們利用高分辨率核磁共振譜學(xué)方法,解析了Dkk2C的溶液三維結(jié)構(gòu)。Dkk2C屬于富含二硫鍵的扁平的小蛋白分子,具有對稱的折疊模式。Dkk2C結(jié)構(gòu)含有

4、兩個由反平行β折疊組成的β片層核心區(qū)域,不同長度的柔性區(qū)域?qū)⑦@些β折疊連接起來,分子內(nèi)的五個雙硫鍵將整個分子緊密的折疊在一起,導(dǎo)致了分子的高度穩(wěn)定性。 以前的定點突變研究確定了Dkk和LRP5/6相互作用的可能的結(jié)合位點,以此為指導(dǎo),我們利用軟件HADDOCK的蛋白一蛋白對接模擬計算的方法構(gòu)建了Dkk2C與LRP5/6胞外三個β螺旋槳結(jié)構(gòu)域(分別稱為LRP5-PD1、LRP5-PD2和LRP5-PD3)相互作用的復(fù)合物結(jié)構(gòu),建

5、立了Dkk與LRP5/6相互作用的模型。結(jié)果顯示,在酸性pH條件下,Dkk2C選擇性與LRP5-PD3結(jié)合,并具有最大親和力；另外,Dkk2C中的殘基H198及其質(zhì)子化狀態(tài)對于Dkk2C和LRP5-PD3的結(jié)合十分關(guān)鍵,提示pH在調(diào)節(jié)Dkk2C結(jié)合LRP5/6胞外β螺旋槳結(jié)構(gòu)域從而抑制Wnt信號通路中發(fā)揮重要作用。最后,我們利用核磁共振譜學(xué)方法解析了Dkk2N的溶液三維結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)Dkk2N與Dkk2C的結(jié)構(gòu)具有明顯的相似性。對全長Dkk

6、2的研究表明,Dkk2C與Dkk2N在全長Dkk2分子中是相互獨立的,彼此間不存在相互作用。 這些研究結(jié)果不僅增加了我們對Dkk調(diào)節(jié)規(guī)范型Wnt信號通路的理解而且擴展了尋找新型治療靶點的范圍,對于基礎(chǔ)科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)治療都具有重要意義。 此外,我們還研究了蘆薈大黃素對正常和細菌脂多糖(LPS)刺激的大鼠腹腔巨噬細胞(pMtp)釋放TNF-α和[Ca2+]i動力學(xué)的影響。其效應(yīng)表現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)作用,低濃度時對[Ca2+]i