AGEs-RAGE軸激活AKT信號通路促進人主動脈血管平滑肌細胞增殖和遷移.pdf

1、目的：探究晚期糖基化終末產物（Advanced Glycation End Products,AGEs）對人主動脈血管平滑肌細胞(Human Aorta Vascular Smooth Muscle Cells,HASMCs)增殖和遷移的影響，進而探究ERK1/2、P38MAPK、JNK及AKT等相關信號通路是否參與HASMCs增殖和遷移。進一步探究AGEs是否與其受體RAGE以配體-受體相結合方式啟動其下游信號通路參與HASMCs的增

2、殖與遷移。為糖尿病血管動脈粥樣硬化，血管腔內成形術（Percutaneous Transluminal Angioplasty,PTA）術后再狹窄等狹窄、閉塞性病變的防治提供新的策略。
　　方法：CCK-8法及EdU法檢測HASMCs在不同濃度AGEs作用下增殖情況，流式細胞儀檢測上述對應濃度條件下的AGEs對HASMCs周期轉換情況；細胞劃痕實驗及Transwell實驗測定HASMCs在上述對應濃度條件的AGEs刺激下其遷移情況

3、，羅丹明-鬼筆環(huán)肽熒光染色后，通過激光共聚焦熒光顯微鏡觀察HASMCs纖維肌動蛋白(F-actin)的表達情況；蛋白印跡技術(western blot)測定平滑肌細胞增殖與遷移相關蛋白的表達情況；PD98059（ERK1/2 inhibitor），SB203580(P38 inhibitor),SP600125(JNK inhibitor),LY294002(AKT inhibitor)分別預處理HASMCs，1小時之后，再加入一定濃度

4、的AGEs，繼續(xù)培養(yǎng)細胞24～48h,通過上述實驗方法檢測HASMCs增殖和遷移能力以及與增殖和遷移相關的蛋白質表達情況；經過以上實驗的初步探索，我們發(fā)現抑制AKT信號通路之后，HASMCs的增殖和遷移活性均被明顯抑制，表明AKT通路在AGEs誘導的HASMCs增殖和遷移過程中同時發(fā)揮重要的促進作用。故實驗進一步選用AKT-siRNA轉染HASMCs構建起AKT被干擾的細胞模型，同時選用RAGE-RANi慢病毒轉入細胞構建起RAGE基因

5、沉默的HASMCs模型，以探究AGEs/RAGE軸與AKT信號通路之間的關系。慢病毒載體上標記有綠色熒光蛋白基因（Green Fluorescein Protein,GFP)，當細胞被成功轉染病毒后，可以穩(wěn)定表達GFP,通過熒光顯微鏡可以觀察HASMCs的轉染效率，western blot檢測AKT蛋白和RAGE蛋白的以驗證轉染是否成功。轉染成功后，經AGEs干預、誘導，再通過western blot測定RAGE、AKT以及增殖和遷移相

6、關蛋白的表達情況。
　　結果：
　　1、在一定濃度范圍內，AGEs能促進HASMCs增殖和遷移。當AGEs濃度在0～10mg/l范圍內時，HASMCs增殖活性逐漸增強，在10mg/l時細胞增殖數量達最高峰，超出范圍后其增殖活性逐漸減弱，且濃度超過40mg/l后，細胞開始凋亡；當AGEs濃度在0～20mg/l范圍內時，HASMCs遷移活性逐漸增強，在20mg/l時細胞遷移數量達最高峰，超出范圍后其遷移能力逐漸減弱。
　　

7、2、HASMCs經PD98059(20μmol／l)預處理后，其增殖活性被顯著抑制（P<0.05,n=3）；同時觀察到JNK的特異性抑制劑SP600125(40μmol／l)能顯著抑制AGEs誘導的平滑肌細胞遷移（P<0.05,n=3）；而HASMCs經SB203580預處理后其增殖與遷移均無明顯抑制效應（P>0.05,n=3）；但同時我們也觀察到，HASMCs經LY294002(40μmol／l)預處理后，其增殖和遷移活性均被明顯抑制

8、P<0.05,n=3）；
　　3、HASMCs轉染AKT-siRNA后，經western blot檢測，與對照組相比較，轉染AKT-siRNA組細胞內AKT蛋白表達明顯下調P<0.01,n=3）。
　　4、HASMCs轉染RAGE-RANi慢病毒5天后，熒光顯微鏡觀察到細胞穩(wěn)定表達綠色熒光，且經western blot檢測，與對照組相比較，轉染RAGE-RANi組細胞內RAGE蛋白表達明顯下調（P<0.01,n=3）。

9、>　　5、HASMCs的AKT基因被干擾后，其增殖、遷移相關蛋白表達明顯下調（P<0.05,n=3），而當其RAGE基因被沉默后，AKT蛋白的表達明顯下調，同時，增殖、遷移相關蛋白也明顯下調（P<0.05,n=3）。
　　結論：
　　1、AGEs能促進HASMCs增殖和遷移，且在一定范圍內表現為濃度依賴性。
　　2、ERK1/2和JNK分別參與AGEs誘導的HASMCs增殖和遷移，AKT同時參與AGEs誘導的HASMC