Wnt-PCP信號通路與先天性小耳畸形發(fā)病表觀遺傳學(xué)機制的初步研究.pdf

1、目的:
　　從表觀遺傳學(xué)角度出發(fā)，對先天性小耳畸形殘耳軟骨組織及正常耳軟骨組織的全基因組DNA甲基化水平進行對照研究，通過甲基化DEP和ROI深度分析，從中挖掘篩選出與生長發(fā)育密切相關(guān)的Wnt信號通路，驗證其相關(guān)甲基化差異基因Wnt1，Wnt11基因的表達差異，通過對Wnt/PCP通路的干預(yù)了解其在耳廓軟骨細胞增殖與凋亡中的作用，并結(jié)合甲基化水平的異常探討其在先天性小耳畸形發(fā)病中可能的作用機制。
　　方法:
　　1.通

2、過MeDIP Chip技術(shù)獲得先天性小耳畸形全基因甲基化譜并對其進行深度GO和Pathway分析，篩選可能與本病相關(guān)的信號通路和相關(guān)分子。
　　2.對先天性小耳畸形患者和非耳畸形患者軟骨組織，及同一患者殘耳及正常軟骨組織中的wnt1和wnt11基因表達進行Real-time PCR檢測，驗證基因表達狀態(tài)是否與甲基化芯片中Wnt信號通路富集的結(jié)果相一致。
　　3.CCK-8法檢測同一先天性小耳畸形患者來源的正常軟骨和殘耳軟骨細

3、胞的增殖活性，AnnexinⅤ法檢測正常軟骨細胞及殘耳軟骨細胞的凋亡情況。
　　4.分別在同一先天性小耳畸形患者來源的正常軟骨和殘耳軟骨細胞組中加入JNKinhibitorⅡ、同時加入JNK inhibitorⅡ和5氮雜胞嘧啶苷，Real-time PCR檢測不同組間wnt1和wnt11基因表達的變化，Western Blot法檢測Wnt1和Wnt11蛋白含量的變化，確定Wnt/PCP信號通路被充分阻斷后，CCK-8法檢測各組正常

4、軟骨和殘耳軟骨細胞的增殖活性，AnnexinⅤ法檢測各組正常軟骨細胞及殘耳軟骨細胞的凋亡情況。
　　結(jié)果
　　1.對先天性小耳畸形DNA甲基化譜的深度分析，GO分析和Pathway篩選分析發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路是較為富集并且可能與本病發(fā)生密切相關(guān)的信號通路。其相關(guān)基因wnt1及wnt11在正常軟骨的啟動子區(qū)和CpG島呈現(xiàn)高甲基化趨勢，而殘耳軟骨中甲基化水平較低。結(jié)合GO和Pathway的結(jié)果，構(gòu)建了存在甲基化差異表達的Wnt信

5、號通路Network。并針對該通路中存在甲基化改變的wnt1和wnt11基因及其所在的具體信號通路進行進一步研究。
　　2.對先天性小耳畸形患者和非耳畸形患者軟骨組織中wnt1及wnt11的基因表達均未見明顯差異。而對同一先天性小耳畸形患者來源的殘耳軟骨組織中的wnt11基因表達明顯高于正常軟骨組織。
　　3.同一先天性小耳畸形患者來源的正常軟骨和殘耳軟骨第3代細胞形態(tài)與原代及1、2代細胞無明顯差異。殘耳軟骨細胞的增殖能力和

6、凋亡情況與正常軟骨細胞相比未見明顯差異。
　　4.分別向殘耳軟骨細胞及正常軟骨細胞中加入JNK inhibitorⅡ和同時加入JNKinhibitorⅡ及5氮雜胞嘧啶苷后，第3代殘耳軟骨細胞及正常軟骨細胞的形態(tài)與對照組相比均沒有發(fā)生明顯的改變。通過實時定量PCR的檢測，殘耳軟骨細胞及正常軟骨細胞中JNK inhibitorⅡ組wnt11基因的表達均低于對照組。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)殘耳軟骨細胞及正常軟骨細胞中JNK in

7、hibitorⅡ組Wnt11蛋白的表達均低于對照組。在Wnt/PCP信號通路被有效阻斷后，正常軟骨細胞和殘耳軟骨細胞JNKinhibitorⅡ組的增殖能力均高于對照組，其生長曲線的擬合也與該結(jié)果相吻合。在細胞凋亡的測定中，JNK InhibitorⅡ組活細胞百分比明顯高于對照組，總凋亡細胞百分比明顯低于對照組。同時加入JNK inhibitorⅡ及5氮雜胞嘧啶苷組軟骨細胞的增殖與凋亡與對照組相比未見明顯差異。
　　結(jié)論
　　

8、先天性小耳畸形全基因組甲基化芯片的深度分析及篩選發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路的DNA甲基化水平存在差異，選擇該通路中甲基化水平差異表達基因wnt1和wnt11基因進一步進行驗證，在同一患者的配對研究中發(fā)現(xiàn)其殘耳軟骨中wnt11基因表達水平較其正常耳軟骨高。這與其啟動子區(qū)CpG島DNA甲基化的狀態(tài)相一致。先天性小耳畸形患者殘耳軟骨細胞與正常軟骨細胞具有同等的增殖能力，可以作為組織工程耳種子細胞的來源選擇。在耳廓軟骨細胞中加入JNK inhibito