人骨髓間充質干細胞衰老的動態(tài)生物學研究.pdf

1、衰老是生物體不可避免的生命規(guī)律。隨著生物體年齡的增加，機體器官的組織結構和生理功能進行性衰退，最終引起衰老相關老年性疾病。目前，對于衰老研究形成了多種衰老學說，其中干細胞衰老學說是解釋機體衰老的最新學說，該學說認為：生物體的衰老實際上是它的干細胞衰老，所有衰老現(xiàn)象包括組織器官退變、功能喪失、腫瘤發(fā)生和反復感染等老年性疾病都可以反映出成體干細胞衰老的水平。此外，由于干細胞的衰老導致其自我更新和多向分化能力衰退，這也必將導致組織器官結構與功

2、能的逐漸衰退、損傷組織難以修復再生和伴隨疾病的產(chǎn)生?？茖W家提出：干細胞是研究細胞衰老的最好模型，尋找重新激活干細胞的方法和調控它靶向分化在預防老年疾病和治療退行性疾病中有不可估量的價值。
　　造血誘導微環(huán)境（hematopoietic inductive microenvironment，HIM）是造血干細胞（haemopoietic stem cells，HSCs）賴以生長發(fā)育和增殖分化的場所，其結構和功能完整是維系正常造血功能

3、的重要因素。造血基質細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）作為HIM的核心組分，不僅通過形成HSCs生長發(fā)育的“龕”、分泌造血生長因子和細胞外基質等方式支持和調控HSCs自我更新與分化，還與多種血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關，因此骨髓基質細胞成為研究HIM結構與功能最為重要的研究對象。課題組前期研究證明，隨著小鼠年齡增加，其HSCs也隨之衰老，最終導致衰老相關性老年疾病的發(fā)生?，F(xiàn)代造血理論認為，骨

4、髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）對于維持造血誘導微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)具有重要意義，它可以增殖、分化形成多種BMSCs，此外，BMMSCs還可以通過分泌多種造血調控因子調控造血干細胞功能。因此，BMMSCs成為研究造血誘導微環(huán)境重要對象。
　　最新研究表明，體外培養(yǎng)的BMMSCs會隨著傳代數(shù)的增加而出現(xiàn)衰老，最終導致相關功能的喪失。隨著年齡增加，人BMMSCs衰老的動態(tài)生物

5、學特征規(guī)律還不清楚。本文采用現(xiàn)代干細胞研究的最新手段，深入探討隨著年齡的增加人骨髓間充質干細胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMMSCs）衰老的動態(tài)生物學規(guī)律，旨在為探索延緩或預防造血微環(huán)境衰老途經(jīng)提供理論及實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.人骨髓間充質干細胞（hBMMSCs）的分離與鑒定：采集健康人骨髓，分離骨髓單個核細胞（BNCS），體外貼壁培養(yǎng)BNCS，傳代至第三代

6、（P3），收集P3代細胞，流式細胞術鑒定細胞表面CD90、CD73、CD11b、CD19、CD14和HLA-DR的表型表達。
　　2.采集健康人骨髓，分離骨髓單個核細胞（BNCS），貼壁培養(yǎng)至P3，根據(jù)年齡分為：青年組（10例，15?25歲），中年組（12例，26?45歲），中老年組（15例，45?65歲），老年組（12例，＞65歲），分組后進行以下檢測。
　?。?）增殖分化能力檢測：采用CCK-8檢測各組hBMMSCs的增

7、殖能力，使用成骨分化誘導劑和成脂分化誘導劑誘導hBMMSCs，用油紅O和堿性磷酸酶染色分別檢測各組hBMMSCs成脂及成骨分化能力。
　?。?）衰老染色檢測：使用衰老相關-β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色法觀察各組hBMMSCs的衰老變化。
　?。?）氧化損傷檢測：檢測各組hBMMSCs胞內總抗氧化能力、總SOD含量、總谷胱甘肽過氧化物酶活力、MDA和ROS含量。
　?。?）炎癥因子檢測：使用ELISA檢測各組h

8、BMMSCs培養(yǎng)上清液中的IL-2、IL-6和TNF-α的水平。
　?。?）RT-PCR檢測:各組hBMMSCs衰老相關基因P53、P21 mRNA水平的表達。
　　結果：
　　1.流式細胞術檢測結果顯示hBMMSCs表面抗原高表達CD73和CD90，也表達 CD11b，但低表達 CD19、CD14、HLA-DR，具有成脂、成骨分化能力，符合國際細胞學會對于間充質干細胞的定義。
　　2.青年組、中年組、中老年組和

9、老年組hBMMSCs隨著年齡增長，其增殖能力、成骨分化能力逐漸減弱，但成脂分化能力逐漸增強；SA-β-Gal染色陽性的hBMMSCs數(shù)逐漸增多，周期發(fā)生阻滯，凋亡率逐漸增加；胞內MDA及ROS含量逐漸增加，總抗氧化能力、SOD及總谷胱甘肽過氧化物酶活力逐漸降低；炎癥因子IL-6和TNF-α水平逐漸升高，IL-2水平逐漸減低。
　　3.RT-PCR結果顯示：hBMMSCs衰老相關p53和p21 mRNA表達水平隨著年齡增加而上調。<