人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衰老過(guò)程中DNA損傷應(yīng)答特性研究.pdf

1、正常細(xì)胞受到Hayflick限制,不能發(fā)生無(wú)限增殖,衰老成為其最終結(jié)局,現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)存在少部分細(xì)胞發(fā)生衰老逃逸,使這些基因組高度不穩(wěn)定的衰老細(xì)胞發(fā)生癌變。干細(xì)胞作為成體組織細(xì)胞更新來(lái)源,具有生存周期長(zhǎng)的特點(diǎn),容易受到各種內(nèi)外因素的作用,相比生命周期短的分化細(xì)胞受到更多的DNA損傷,容易導(dǎo)致?lián)p傷的大量積累,而干細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖和分化潛能,基因組的不穩(wěn)定更易引發(fā)衰老和癌變。為保證基因組的穩(wěn)定,防止惡性轉(zhuǎn)化,細(xì)胞存在一個(gè)龐大的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行“糾錯(cuò)

2、”,DNA修復(fù)就是其中一種重要機(jī)制。對(duì)DNA損傷應(yīng)答機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn),如果細(xì)胞DNA損傷應(yīng)答異常,同樣會(huì)出現(xiàn)基因組不穩(wěn)定現(xiàn)象,使細(xì)胞易發(fā)生衰老和惡性轉(zhuǎn)化。已有文獻(xiàn)報(bào)道,衰老細(xì)胞DNA損傷修復(fù)基因表達(dá)下調(diào)及核型異常,而在對(duì)基因敲除鼠和人類(lèi)基因缺陷病患者的研究中,也發(fā)現(xiàn)DNA損傷修復(fù)基因缺失的細(xì)胞出現(xiàn)早衰現(xiàn)象。由此,我們認(rèn)為細(xì)胞衰老與DNA損傷應(yīng)答,以及腫瘤的發(fā)生具有密切聯(lián)系。然而,衰老細(xì)胞的DNA損傷應(yīng)答能力如何并無(wú)相關(guān)報(bào)道,所以我們提出推

3、斷:干細(xì)胞衰老過(guò)程中DNA損傷應(yīng)答能力下降可能加速干細(xì)胞衰老并且使細(xì)胞功能下降,同時(shí)破壞細(xì)胞凋亡屏障,促發(fā)干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。
　　目的:
　　以氧化損傷和DNA雙鏈斷裂損傷為模型,觀察衰老細(xì)胞DNA損傷應(yīng)答情況,探索DNA損傷應(yīng)答異常是衰老細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性的直接原因。
　　方法:
　　1.培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,用流式細(xì)胞技術(shù)和定向誘導(dǎo)分化對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。2.衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶檢測(cè)細(xì)胞衰老情況,BrdU摻入實(shí)

4、驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,QPCR檢測(cè)衰老相關(guān)基因,建立體外培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衰老模型。3.建立氧化損傷和DNA雙鏈斷裂損傷模型觀察細(xì)胞DNA損傷和損傷后應(yīng)答情況。通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活情況檢測(cè)細(xì)胞對(duì)損傷的敏感性,DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧,單細(xì)胞凝膠電泳和γH2AXfoci觀察細(xì)胞DNA損傷和損傷后應(yīng)答情況,QPCR檢測(cè)參與損傷后應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)情況。
　　結(jié)果與結(jié)論:
　　1.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)長(zhǎng)期體

5、外培養(yǎng)至40代以后,衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多,增殖能力明顯下降,衰老相關(guān)基因表達(dá)增高,提示間充質(zhì)干細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)后發(fā)生衰老。2.生存曲線結(jié)果顯示H2O2作用下,年輕間充質(zhì)干細(xì)胞存活率明顯高于衰老間充質(zhì)干細(xì)胞;活性氧及堿性單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果顯示,衰老間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)H2O2損傷更敏感,由H2O2引起的損傷應(yīng)答能力降低,可能與氧化損傷應(yīng)答基因的表達(dá)下調(diào)相關(guān)。3.生存曲線結(jié)果顯示博來(lái)霉素(BLM)作用下,年輕間充質(zhì)干細(xì)胞存活率明