電針穴位刺激對糖尿病大鼠ENS的影響及機制研究.pdf

1、第一部分糖尿病大鼠ENS 變化及機制
　　 研究背景：糖尿病可導(dǎo)致胃腸功能紊亂，并可能存在ENS 腸神經(jīng)元異常，但糖尿病時腸神經(jīng)元異常及其發(fā)生機制尚不十分明確。膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）及其下游信號途徑PI3K/Akt 可能在糖尿病腸神經(jīng)元病變中起重要作用。
　　 目的：探討高糖狀態(tài)下腸神經(jīng)元的損傷情況以及GDNF 及其下游信號途徑PI3K/Akt在腸神經(jīng)元存活中的作用。
　　 方法：選取SD 雄性大鼠

2、32只，隨機分為正常對照組、糖尿病組（糖尿病4周組、糖尿病8周組、糖尿病12周組），每組8只。鏈脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病大鼠模型，對照組給予等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液注射。造模成功后按不同時間點分別取各組大鼠近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸標(biāo)本。P-Akt 作為 PI3K/Akt 信號通路檢測標(biāo)志，PGP9.5作為腸道總神經(jīng)元檢測標(biāo)志。用real-time PCR，SABC 免疫組化法和Western blotting法分別檢測各組GDNF，p-A

3、kt和nNOS（神經(jīng)元型一氧化氮合酶）神經(jīng)元，CHAT（膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶）神經(jīng)元及總神經(jīng)元的mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。
　　 結(jié)果：
　　 （1）與正常對照組相比，近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸GDNF的表達(dá)水平在糖尿病8周及糖尿病12周時均明顯下降。糖尿病12周GDNF的表達(dá)相比糖尿病8周時下降更為明顯。而糖尿病4周與對照組相比GDNF的表達(dá)無明顯差異。
　　 （2）p-Akt的表達(dá)變化趨勢與GDNF的表達(dá)變化相同，即p

4、-Akt的表達(dá)在糖尿病8周和糖尿病12周時與正常對照組相比存在明顯下降。
　　 （3）近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸的nNOS 神經(jīng)元，CHAT 神經(jīng)元及總神經(jīng)元數(shù)目也明顯減少。
　　 結(jié)論：糖尿病可導(dǎo)致腸神經(jīng)元的顯著減少。GDNF 及其下游信號途徑PI3K/Akt作為腸神經(jīng)元存活的重要信號通路之一可能在糖尿病腸神經(jīng)元病變中發(fā)揮重要作用。
　　 第二部分電針刺激對糖尿病大鼠ENS的影響
　　 背景：電針刺激（EA）足

5、三里穴位已被應(yīng)用于減輕胃腸道癥狀，改善胃腸動力。其具體作用機制尚不十分清楚，前一部分研究顯示糖尿病可致腸道神經(jīng)元病變，但電針刺激是否影響ENS 有待于進(jìn)一步研究。
　　 目的：以糖尿病大鼠為模型，研究電針刺激足三里穴位對受損的ENS 神經(jīng)元的作用。初步探討EA 作用的胃腸道機制。
　　 方法：選取SD 雄性大鼠64只，隨機分為8組：正常對照組，糖尿病6周組，糖尿病+慢性高頻EA組，糖尿病+慢性低頻EA組，糖尿病+慢性假性

6、刺激組，糖尿病+急性高頻EA組，糖尿病+急性低頻EA組，糖尿病+急性假性刺激組，每組8只。鏈脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病大鼠模型，對照組給予等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液注射。高頻EA 參數(shù)為100HZ，1mA；低頻EA 參數(shù)為10HZ，1mA；假性刺激組為僅給予針刺，刺激時不通電。慢性EA組自糖尿病造模成功開始給予共6周EA，急性EA組為糖尿病第6周開始給予1周EA，刺激時間為30min/d。造模結(jié)束后分別取各組大鼠近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸標(biāo)本。

7、免疫組化染色觀察總神經(jīng)元PGP9.5的表達(dá)。用免疫熒光雙重染色法觀察PGP9.5和nNOS或CHAT的雙重染色的神經(jīng)元表達(dá)情況。用real-time和Western blotting 法分別檢測各組總神經(jīng)元PGP9.5，代表性的抑制性神經(jīng)元nNOS和興奮性神經(jīng)元CHAT的mRNA和蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：總神經(jīng)元和nNOS、CHAT 兩種神經(jīng)元在近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸的mRNA和蛋白表達(dá)在DM6周時均較正常對照組明顯下降。慢性

8、高頻EA組與DM組和DM+其他EA組相比，總神經(jīng)元，nNOS、CHAT 兩種神經(jīng)元的表達(dá)在近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸均明顯增加。
　　 結(jié)論：慢性高頻電針刺激足三里可使糖尿病大鼠損傷的腸道神經(jīng)元發(fā)生修復(fù)。
　　 第三部分電針刺激對糖尿病大鼠ENS 影響的機制
　　 研究背景：第二部分研究顯示慢性高頻電針刺激對糖尿病大鼠結(jié)腸受損的腸神經(jīng)元有修復(fù)作用，但其具體作用機制尚不清楚。第一部分研究結(jié)果提示GDNF 及下游信號途徑PI

9、3K/Akt 作為腸神經(jīng)元存活的重要信號通路之一在糖尿病腸神經(jīng)元病變中可能發(fā)揮重要作用，但其是否參與電針刺激對神經(jīng)元病變的修復(fù)需進(jìn)一步研究。
　　 目的：以糖尿病大鼠為模型，研究電針刺激足三里穴位對受損的ENS 神經(jīng)元修復(fù)的可能機制。
　　 方法：選取SD 雄性大鼠64只，隨機分為8組：正常對照組，糖尿病6周組，糖尿病+慢性高頻EA組，糖尿病+慢性低頻EA組，糖尿病+慢性假性刺激組，糖尿病+急性高頻EA組，糖尿病+急性低

10、頻EA組，糖尿病+急性假性刺激組，每組8只。鏈脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病大鼠模型，對照組給予等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液注射。高頻EA 參數(shù)為100HZ，1mA；低頻EA 參數(shù)為10HZ，1mA；假性刺激組為僅給予針刺，刺激時不通電。慢性EA組自糖尿病造模成功開始給予共6周EA，急性EA組為糖尿病第6周開始給予1周EA，刺激時間為30min/d。造模結(jié)束后分別取各組大鼠近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸標(biāo)本。用real-time和Western blot