簡介：目的以青年患者為研究對象，觀察異氟烷和丙泊酚對青年患者心臟瓣膜置換術(shù)后早期認(rèn)知功能和血清S100B、NSE和MDA的影響。方法30例因患風(fēng)心病行瓣膜置換術(shù)的18～45歲的青年患者，隨機(jī)分兩組，異氟烷組（Ⅰ組）15例，丙泊酚組P組15例。兩組患者均采用靜脈注射咪達(dá)唑侖01MGKG1，芬太尼5ΜGKG1及維庫溴銨01MGKG1麻醉誘導(dǎo)，氣管插管后機(jī)控呼吸，在心肺轉(zhuǎn)流術(shù)下行心內(nèi)直視手術(shù)。Ⅰ組以吸入異氟烷復(fù)合芬太尼、咪達(dá)唑侖、維庫溴銨靜脈注射維持麻醉，吸入異氟烷呼末最低肺泡有效濃度MAC維持在15左右。P組用丙泊酚4～6MGKG1H1持續(xù)泵入，復(fù)合芬太尼、咪達(dá)唑侖、維庫溴銨靜脈注射維持麻醉。分別于麻醉前T1、轉(zhuǎn)機(jī)前即刻T2停機(jī)后即刻T3、停機(jī)后8HT4、停機(jī)后24HT5抽血測定血清S100B蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶NSE、丙二醛MDA含量。并于手術(shù)前1天，手術(shù)后第7天應(yīng)用簡易智力量表MMSE、焦慮自評量表SAS和抑郁自評量表SDS進(jìn)行測試，MMSE評分較術(shù)前基礎(chǔ)值下降1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差認(rèn)為有認(rèn)知功能障礙發(fā)生。結(jié)果1患者一般情況兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、血?dú)庵笜?biāo)、心肺轉(zhuǎn)流時(shí)間、主動(dòng)脈阻斷時(shí)間、換瓣個(gè)數(shù)也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞005）。2S100BⅠ組與P組比較在T1、T2、T5時(shí)點(diǎn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＞005，T3、T4時(shí)點(diǎn)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜001組內(nèi)T3、T4時(shí)點(diǎn)S100B濃度分別與T1、T2、T5時(shí)點(diǎn)比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜001，在T3時(shí)點(diǎn)S100B濃度最高。3NSEⅠ組與P組比較T3、T4時(shí)點(diǎn)NSE濃度有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜001），組內(nèi)T3、T4時(shí)點(diǎn)NSE濃度明顯升高，分別與T1、T2比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜001）。4MDAⅠ組和P組比較T1、T2、T4、T5時(shí)點(diǎn)MDA濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＞005，T3時(shí)點(diǎn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜005組內(nèi)T3、T4濃度明顯升高，分別與T1、T2、T5比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜001。5SAS，SDS，MMSE量表評估術(shù)前1D，術(shù)后7D，SAS，SDS標(biāo)準(zhǔn)評分均＜50分，組間和組內(nèi)比較各時(shí)點(diǎn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞005。MMSE評分Ⅰ組和P組比較術(shù)前1D、術(shù)后7D均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞005。組內(nèi)比較各組的MMSE評分術(shù)后7D要明顯低于術(shù)前1D，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ⅰ組P＜001P組P＜005）。MMSE評分術(shù)后7D，術(shù)前1D比較，以低于1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差確定為發(fā)生了認(rèn)知功能障礙為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示，異氟烷組和丙泊酚組都有POCD患者發(fā)生，異氟烷組發(fā)生6例，丙泊酚組發(fā)生4例，經(jīng)四格表資料卡方檢驗(yàn)的精確概率檢驗(yàn)法分析兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＞005。結(jié)論通過異氟烷和丙泊酚對青年患者心臟瓣膜置換術(shù)后早期認(rèn)知功能的影響研究，在本實(shí)驗(yàn)觀察例數(shù)內(nèi)得出以下結(jié)論1在異氟烷麻醉和丙泊酚麻醉下，青年患者心臟瓣膜置換術(shù)后早期認(rèn)知功能都有下降。2在異氟烷和丙泊酚麻醉下的青年患者心臟瓣膜置換術(shù)中，S100B，NSE，MDA均升高，異氟烷麻醉下的血清濃度要顯著高于丙泊酚麻醉。提示異氟烷麻醉下青年患者心臟瓣膜置換術(shù)后的腦損傷作用可能要高于丙泊酚麻醉。

簡介：腸道病毒71型（ENTEROVIRUS71，EV71）是導(dǎo)致嬰幼兒感染的重要病原之一，可引起多種疾病，具有較廣的疾病譜。其中由EV71引起的兒童手足口?。℉，F(xiàn)OOT，MOUTHDISEASE，HFMD）最為常見，而且在嬰幼兒容易造成腦干腦炎等神經(jīng)系統(tǒng)感染導(dǎo)致死亡。EV71近年有多地區(qū)流行的趨勢。EV71在分類上屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，基因組為正鏈單股RNA?；蚪M全長7500BP，編碼區(qū)僅有一個(gè)開放閱讀框（F），編碼約2200個(gè)氨基酸的多聚蛋白（POLYPROTEIN），該多聚蛋白可進(jìn)一步被水解成P1、P2、P3三個(gè)前體蛋白，P1蛋白在3CD蛋白酶的切割作用下生成VP1、VP2、VP3與VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白。其中VP1、VP2和VP3裸露于病毒顆粒的表面，VP4位于病毒顆粒衣殼內(nèi)側(cè)與基因組RNA緊密連接，共同構(gòu)成EV71的抗原區(qū)。研究資料表明，雖然該病毒主要抗原決定區(qū)位于VP1，但是VP2、VP3以及VP4上均有抗原抗體結(jié)合功能；已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示單獨(dú)的VP1和VP3免疫原性有限，若能獲得VP1～VP4，免疫原性將會(huì)得到明顯提高。鑒于此，我們首先對從流行區(qū)分離的EV71病毒進(jìn)行了血清學(xué)和分子生物學(xué)方面的鑒定，采用RTPCR的方法克隆了P1和3CD基因，借助于載體PCDNA30BA構(gòu)建雙順反子穿梭質(zhì)粒PSHUTTLECMVP13CD和單基因的穿梭質(zhì)粒PSHUTTLECMVP1與PSHUTTLECMV3CD。經(jīng)同源重組獲得了重組腺病毒質(zhì)粒RADP13CD、RADP1、RAD3CD，分別轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行包裝，獲得相應(yīng)的重組腺病毒RADP13CD、RADP1和RAD3CD，經(jīng)RTPCR檢測表明，三個(gè)重組腺病毒均已轉(zhuǎn)錄目的基因MRNA；免疫熒光和免疫組化檢測結(jié)果表明僅雙順反子重組腺病毒RADP13CD中可檢測到特異性目的蛋白，而RADP1、RAD3CD中未能檢測到特異性的表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果表明重組腺病毒可有效表達(dá)EV71P1和3CD基因，僅含P1或3CD基因的重組腺病毒表達(dá)產(chǎn)物未能被特異性抗體所識別，而含P1及3CD蛋白酶基因的雙順反子重組腺病毒表達(dá)產(chǎn)物具有EV71特異抗原性，提示P1蛋白只有在3CD蛋白酶的切割作用下才具有抗原性；重組腺病毒通過滴鼻、灌胃和皮下注射的方式分別免疫BALBC小鼠，ELISA法檢測結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中均檢測到抗EV71特異性IGG的抗體，且由RADP13CD免疫后產(chǎn)生的抗體水平明顯高于RADP1和RAD3CD共免疫產(chǎn)生的抗體水平；三種不同的免疫方式結(jié)果證明，灌胃免疫方式最佳，滴鼻次之，皮下注射產(chǎn)生的抗體水平最低。目前有限次數(shù)的中和試驗(yàn)還未能在實(shí)驗(yàn)組血清中檢測到EV71特異性保護(hù)作用，其原因還有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)成功克隆了包含EV71全部結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)基因P1和具有切割作用的蛋白酶3CD，初步探索了EV71病毒蛋白之間的相互作用，為研究EV71結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白之間的關(guān)系打下了基礎(chǔ)；為找尋最合理的相關(guān)重組腺病毒疫苗的免疫方式做了初步的探索實(shí)驗(yàn)，為EV71基因工程疫苗的研究做了前期的基礎(chǔ)工作。

簡介：點(diǎn)擊查看更多基于日本腦炎病毒復(fù)制子載體系統(tǒng)的疫苗研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：研究目的1研究乙肝病毒核心蛋白HEPATITISBVIRUSCEPROTEIN，HBC對人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶HUMANTELOMERASEREVERSETRANASEHTERT表達(dá)的調(diào)控作用。2驗(yàn)證HTERT在HBC調(diào)控肝癌細(xì)胞生長、增殖中的關(guān)鍵作用。3探討乙肝病毒核心蛋白HBC調(diào)控HTERT表達(dá)的分子機(jī)制。研究方法1HBC蛋白影響肝癌細(xì)胞生長的體內(nèi)試驗(yàn)研究課題組前期試驗(yàn)結(jié)果顯示，HBC可在體外增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的生長及克隆增殖能力。本論文在此研究基礎(chǔ)上，利用裸鼠皮下成瘤模型在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證該現(xiàn)象。將HEPG2215細(xì)胞（1107個(gè)02ML）皮下接種裸鼠，經(jīng)10D左右腫瘤直徑達(dá)05CM。將成瘤小鼠隨機(jī)分為兩組，每隔3D分別注射2UGPSHRNAHBC質(zhì)粒和PSHRNANC質(zhì)粒，每隔1D測量腫瘤直徑大小，計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。2W后，處死裸鼠，取出瘤體，稱量瘤重。同時(shí)，提取腫瘤組織總RNA，RTPCR檢測HTERT和HBCMRNA的表達(dá)情況。2HBC蛋白對HTERT基因表達(dá)的調(diào)控作用21HBC蛋白對HTERT表達(dá)的影響課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HBC可以促進(jìn)BEL7402細(xì)胞中HTERTMRNA的表達(dá)，同時(shí)PSHRNAHBC亦可抑制HEPG2215細(xì)胞中HTERTMRNA的表達(dá)。本論文在此基礎(chǔ)上，將PCDNA3HBCHA質(zhì)粒和PCDNA3質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入BEL7402、HELA以及HEPG2細(xì)胞中，培養(yǎng)48H后提取總蛋白，WESTERNBLOT檢測HTERT的蛋白的表達(dá)情況。同時(shí)為了進(jìn)一步檢測HTERT的表達(dá)定位情況，我們在HELA細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)入PCDNA3HBCHA質(zhì)粒和PCDNA3質(zhì)粒，48H后進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，使用熒光抗體標(biāo)記HTERT蛋白，DAPI染核后利用熒光顯微鏡觀察HTERT的表達(dá)及定位情況。22肝細(xì)胞肝癌組織標(biāo)本中HBC與HTERT表達(dá)的相關(guān)性分析上述細(xì)胞試驗(yàn)完成后，我們又選取了16例肝細(xì)胞肝癌HEPATOCELLULARCARCINOMAHCC組織標(biāo)本，分別提取各樣本的RNA和蛋白質(zhì)，RTPCR檢測每例標(biāo)本中HBC表達(dá)情況后，將各組織標(biāo)本分為HBC陽性和HBC陰性兩組。利用WESTERNBLOT比較這兩組標(biāo)本中HTERT蛋白的表達(dá)情況，光密度掃描分析蛋白表達(dá)強(qiáng)度，最后繪制散點(diǎn)圖，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組標(biāo)本中HTERT蛋白表達(dá)的差異。3HTERT在HBC促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長中的作用為了進(jìn)一步研究HBC，HTERT和細(xì)胞增長之間的關(guān)系，我們將HTERTSI或NCSI與PCDNA3HBCHA或PCDNA3表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至BEL7402細(xì)胞中，繪制生長曲線并進(jìn)行克隆形成試驗(yàn)，檢測BEL7402細(xì)胞的生長、增殖情況。另一方面，將HTERTSI或NCSI與HBC干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEPG2215細(xì)胞，繪制生長曲線并進(jìn)行克隆形成試驗(yàn)，檢測HEPG2215細(xì)胞生長、增殖情況，反向驗(yàn)證HTERT在HBC促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長中的作用。4HBC對HTERT啟動(dòng)子活性的調(diào)控機(jī)制研究41HBC對HTERT核心啟動(dòng)子的調(diào)控作用為了明確HBC影響HTERT表達(dá)的機(jī)制，將PCDNA3HBCHA或PCDNA3表達(dá)載體與攜帶有HTERT核心啟動(dòng)子的報(bào)告基因質(zhì)粒PGL3BHTERT371分別共轉(zhuǎn)染至BEL7402，HEPG2細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染PRLTK作為內(nèi)參質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24H后裂解細(xì)胞，利用96孔化學(xué)發(fā)光儀檢測樣品熒光強(qiáng)度，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。另一方面，將PSHRNAHBC或PSHRNANC與攜帶有HTERI核心啟動(dòng)子的報(bào)告基因質(zhì)粒PGL3BHTERT371，以及內(nèi)參質(zhì)粒PRLTK共轉(zhuǎn)染HEPG2215細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24H后裂解細(xì)胞，利用96孔化學(xué)發(fā)光儀檢測樣品熒光強(qiáng)度，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，反向驗(yàn)證HBC對HTERT核心啟動(dòng)子的調(diào)控作用。42HBC調(diào)節(jié)HTERT啟動(dòng)子活性關(guān)鍵區(qū)域的尋找為進(jìn)一步明確HBC調(diào)節(jié)HTERT啟動(dòng)子活性的關(guān)鍵區(qū)域，將PCDNA3HBCHA或PCDNA3表達(dá)載體與一系列截短缺失的HTERT啟動(dòng)子報(bào)告基因載體和內(nèi)參質(zhì)粒PRLTK共轉(zhuǎn)染至BEL7402和HEPG2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24H后裂解細(xì)胞，利用96孔化學(xué)發(fā)光儀檢測樣品熒光強(qiáng)度。另一方面，利用PSHRNAHBC封閉HBC的表達(dá)后，將一系列截短缺失的HTERT啟動(dòng)子報(bào)告基因載體和內(nèi)參質(zhì)粒PRLTK共轉(zhuǎn)染至HEPG2215細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24H后裂解細(xì)胞，利用96孔化學(xué)發(fā)光儀檢測樣品的熒光強(qiáng)度。43HBC調(diào)節(jié)HTERT啟動(dòng)子活性關(guān)鍵位點(diǎn)的尋找明確HBC影響HTERT啟動(dòng)子活性的關(guān)鍵區(qū)域后，我們通過相應(yīng)的文獻(xiàn)1分析了關(guān)鍵區(qū)域中包含的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中包括CETS2的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合相關(guān)的文獻(xiàn)2，轉(zhuǎn)錄因子CETS2在調(diào)控和維持HTERT基因啟動(dòng)子的活性中發(fā)揮重要作用。因此，我們設(shè)計(jì)并構(gòu)建了CETS2結(jié)合位點(diǎn)突變的HTERT核心啟動(dòng)子報(bào)告基因載體，將PCDNA3HBCHA或PCDNA3表達(dá)載體與CETS2結(jié)合位點(diǎn)突變或野生型HTERT核心啟動(dòng)子報(bào)告基因載體，以及內(nèi)參質(zhì)粒PRLTK分別共轉(zhuǎn)染BEL7402細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24H后裂解細(xì)胞，利用96孔化學(xué)發(fā)光儀檢測樣品熒光強(qiáng)度。另一方面，將PSHRNAHBC或PSHRNANC與CETS2結(jié)合位點(diǎn)突變或野生型HTERT核心啟動(dòng)子報(bào)告基因載體，以及內(nèi)參質(zhì)粒PRLTK共轉(zhuǎn)染HEPG2215細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24H后裂解細(xì)胞，利用96孔化學(xué)發(fā)光儀檢測樣品的熒光強(qiáng)度。5CETS2蛋白及相關(guān)信號通路分子在HBC調(diào)控HTERT表達(dá)中的作用研究51HBC對CETS2蛋白核轉(zhuǎn)位的影響結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道3，CETS2蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用依賴于其從胞漿到胞核的轉(zhuǎn)位過程。因此，我們將PCDNA3HBCHA或PCDNA3表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24H后，分別提取兩組細(xì)胞的胞核蛋白和胞漿蛋白，通過WESTERNBLOT檢測CETS2蛋白在胞質(zhì)、胞核中的表達(dá)變化，明確HBC是否影響CETS2蛋白的核轉(zhuǎn)位。52HCC組織標(biāo)本中HBC表達(dá)與CETS2蛋白細(xì)胞定位的相關(guān)性分析在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們又提取了上述HCC組織標(biāo)本的胞漿、胞核蛋白，WESTERNBLOT檢測HBC陽性和HBC陰性兩組標(biāo)本中CETS2蛋白的細(xì)胞定位情況，光密度掃描分析蛋白表達(dá)強(qiáng)度，最后做出散點(diǎn)圖進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析。53CETS2在HBC調(diào)控HTERT基因表達(dá)中的作用為了進(jìn)一步驗(yàn)證CETS2在HBC調(diào)節(jié)HTERT表達(dá)中的關(guān)鍵作用，我們將PCDNA3HBCHA或PCDNA3表達(dá)載體與CETS2SI或NCSI分別共轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞，24H后提取RNA，RTPCR檢測HTERT基因MRNA的表達(dá)情況。54HBC對ERK通路活化的影響已有文獻(xiàn)報(bào)道3，ERK信號通路的活化可磷酸化CETS2蛋白，進(jìn)而促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位過程。因此，我們將PCDNA3HBCHA或PCDNA3表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染HELA和HEPG2細(xì)胞，24H、36H和48H后提取細(xì)胞總蛋白，WESTERNBLOT檢測PERK12的表達(dá)情況，驗(yàn)證HBC是否影響ERK信號通路的活化。研究結(jié)果1HBC蛋白可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的體內(nèi)生長在裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中，檢測裸鼠體內(nèi)腫瘤體積大小和瘤重等指標(biāo)，結(jié)果顯示PSHRNAHBC注射組的腫瘤的體積和瘤重均明顯小于PSHRNANC質(zhì)粒注射組（P＜005）。RTPCR顯示PSHRNAHBC注射組腫瘤組織中HTERT的MRNA表達(dá)量明顯低于對照組。2HBC可上調(diào)HTERT蛋白的表達(dá)21HBC可上調(diào)肝癌細(xì)胞系中HTERT蛋白的表達(dá)將PCDNA3HBCHA或PCDNA3表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至BEL7402，HELA，HEPG2細(xì)胞，WESTERNBLOT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HBC表達(dá)載體組細(xì)胞HTERT蛋白表達(dá)量顯著高于轉(zhuǎn)染空載體組（P＜005）。同時(shí)免疫熒光結(jié)果顯示，HTERT蛋白主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，過表達(dá)HBC可以顯著提高HELA細(xì)胞中HTERT蛋白的表達(dá)。22HBC陽性肝癌組織中HTERT蛋白的表達(dá)顯著升高選取16例HCC組織標(biāo)本，分別提取各樣本的RNA和蛋白質(zhì)，通過RTPCR將各組織標(biāo)本分為6例HBC陰性標(biāo)本和10例HBC陽性標(biāo)本。WESTERNBLOT檢測HTERT蛋白的表達(dá)，結(jié)果蛋白條帶進(jìn)行光密度掃描，計(jì)算相對表達(dá)量HTERTΒACTIN，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示HBC陽性HCC標(biāo)本中HTERT蛋白表達(dá)水平顯著高于HBC陰性組（P＜005）。3HTERT在HBC促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長中發(fā)揮重要作用生長曲線和克隆形成試驗(yàn)的結(jié)果顯示，過表達(dá)HBC可以增強(qiáng)BEL7402細(xì)胞的生長和克隆形成能力（P＜005），但HTERTSI的轉(zhuǎn)入使細(xì)胞生長顯著受抑制，且可逆轉(zhuǎn)HBC對細(xì)胞生長和克隆增殖的促進(jìn)作用P＞005。另一方面，小干擾RNA封閉HBC的表達(dá)后HEPG2215細(xì)胞的增殖和克隆形成率受到明顯抑制（P＜005），但HTERTSI亦可導(dǎo)致細(xì)胞生長速度的減慢，且可消除PSHRNAHBC和PSHRNANC轉(zhuǎn)染組間細(xì)胞生長和克隆形成能力的差異（P＞005）。以上結(jié)果從正反兩方面驗(yàn)證了HTERT在HBC促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長、增殖過程中發(fā)揮重要作用。4HBC對HTERT啟動(dòng)子活性的調(diào)控機(jī)制研究41HBC蛋白上調(diào)HTERT核心啟動(dòng)子的活性共轉(zhuǎn)染及雙熒光檢測結(jié)果顯示，在BEL7402細(xì)胞中，隨著HBC蛋白表達(dá)量的升高，HTERT核心啟動(dòng)子的活性被顯著上調(diào)（P＜0001），且具有明顯劑量依賴性HEPG2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染HBC組HTERT核心啟動(dòng)子的活性亦明顯高于轉(zhuǎn)染空載體組（P＜005）。另一方面，在HEPG2215細(xì)胞中，小干擾RNA封閉HBC的表達(dá)可明顯下調(diào)HTERT核心啟動(dòng)子的活性（P＜005）。以上結(jié)果顯示，HBC可上調(diào)HTERT核心啟動(dòng)子的活性。42HTERT啟動(dòng)子130～197BP區(qū)域是HBC發(fā)揮調(diào)控作用的關(guān)鍵區(qū)段共轉(zhuǎn)染及雙熒光檢測結(jié)果顯示，HBC的過表達(dá)可以上調(diào)BEL7402和HEPG2細(xì)胞中PGL3BHTERT371，PGL3BHTERT306，PGL3BHTERT197啟動(dòng)子報(bào)告基因的活性（P＜005），而HBC對PGL3BHTERT130啟動(dòng)子的活性無明顯影響另一方面，小干擾RNA封閉HBC的表達(dá)可顯著降低HEPG2215細(xì)胞中PGL3BHTERT371，PGL3BHTERT306，PGL3BHTERT197啟動(dòng)子報(bào)告基因的活性，而不影響PGL3BHTERT130啟動(dòng)子的活性。以上結(jié)果表明，HBC可能通過HTERT啟動(dòng)子130～197BP區(qū)域來促進(jìn)HTERT基因的轉(zhuǎn)錄。43轉(zhuǎn)錄因子CETS2結(jié)合位點(diǎn)是HBC激活HTERT啟動(dòng)子的關(guān)鍵位點(diǎn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道1，在130～197BP區(qū)域內(nèi)存在著CETS2，BHLH2，AP2，NFE2AP2四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。鑒于轉(zhuǎn)錄因子CETS2在維持HTERT轉(zhuǎn)錄活性中的關(guān)鍵作用，我們構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄因子CETS2結(jié)合位點(diǎn)突變的HTERT核心啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒PGL3BCETSMUT。將PGL3BCETSMUT或野生型PGL3BHTERT371啟動(dòng)子報(bào)告基因載體與PCDNA3HBCHA或PCDNA3表達(dá)載體分別共轉(zhuǎn)染BEL7402細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24H后提取蛋白，雙熒光檢測結(jié)果顯示，HBC的過表達(dá)明顯上調(diào)野生型PGL3BHTERT371啟動(dòng)子報(bào)告基因的活性P＜005，而對PGL3BCETSMUT啟動(dòng)子報(bào)告基因的活性無明顯影響。另一方面，在HEPG2215細(xì)胞中，將PSHRNAHBC或PSHRNANC與PGL3BCETSMUT或野生型PGL3BHTERT371啟動(dòng)子報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染HEPG2215細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24H后裂解細(xì)胞，雙熒光檢測結(jié)果顯示，小干擾RNA封閉HBC的表達(dá)明顯抑制野生型PGL3BHTERT371啟動(dòng)子報(bào)告基因的活性P＜005，而不影響CETS2結(jié)合位點(diǎn)突變的PGL3BCETSMUT啟動(dòng)子的活性。以上結(jié)果提示，轉(zhuǎn)錄因子CETS2結(jié)合位點(diǎn)為HBC調(diào)控HTERT啟動(dòng)子活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。5CETS2蛋白及相關(guān)信號通路分子在HBC調(diào)控HTERT表達(dá)中發(fā)揮重要作用51HBC可促進(jìn)肝癌細(xì)胞中CETS2蛋白的核轉(zhuǎn)位WESTERNBLOT結(jié)果顯示，HEPG2細(xì)胞中HBC的過表達(dá)可以使CETS2蛋白的胞核表達(dá)水平顯著升高，而胞漿表達(dá)降低。該結(jié)果提示HBC可促進(jìn)細(xì)胞中CETS2蛋白的核轉(zhuǎn)位。52HBC陽性HCC組織中胞核CETS2蛋白的表達(dá)略有升高WESTERNBLOT檢測HCC組織中CETS2蛋白的胞核表達(dá)，條帶進(jìn)行光密度掃描，計(jì)算相對表達(dá)量CETS2LAMINAC，結(jié)果顯示，HBC陽性HCC組織胞核CETS2蛋白的表達(dá)水平略高于HBC陰性HCC組織，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析未見顯著性差異（P＞005）。53CETS2蛋白在HBC調(diào)控HTERT基因表達(dá)中發(fā)揮關(guān)鍵作用在HEPG2細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染PCDNA3HBCHA或PCDNA3與CETS2SI，RTPCR結(jié)果顯示，與NCSI轉(zhuǎn)染組相比，CETS2SI可顯著下調(diào)HTERTMRNA的表達(dá)水平，且可消除PCDNAHBCHA對HTERT表達(dá)的上調(diào)作用。54HBC蛋白可促進(jìn)ERK通路的活化WESTERNBLOT結(jié)果顯示，在HELA細(xì)胞中，與對照組相比，PCDNA3HBC轉(zhuǎn)染后36H、48H即可促進(jìn)PERK12的表達(dá)，同時(shí)HTERT蛋白的表達(dá)亦被明顯上調(diào)在HEPG2細(xì)胞中，HBC蛋白亦可以促進(jìn)PERK12的表達(dá)。結(jié)合文獻(xiàn)，以上結(jié)果提示ERK通路的活化可能參與了HBC對HTERT蛋白表達(dá)和CETS2蛋白核轉(zhuǎn)位的調(diào)控作用。結(jié)論1HBC蛋白可促進(jìn)肝癌細(xì)胞在體內(nèi)的生長。2HBC可劑量依賴性地上調(diào)HTERT蛋白的表達(dá)，且HTERT在HBC促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長中發(fā)揮重要作用。3HBC蛋白可上調(diào)HTERT啟動(dòng)子的活性，且轉(zhuǎn)錄因子CETS2結(jié)合位點(diǎn)是HBC發(fā)揮調(diào)控作用的的關(guān)鍵位點(diǎn)。4CETS2蛋白及相關(guān)信號通路分子在HBC調(diào)控HTERT表達(dá)中發(fā)揮著重要的作用。意義1該課題第一次提出了HBC對HTERT表達(dá)的調(diào)控作用，驗(yàn)證了HTERT在HBC調(diào)控肝癌細(xì)胞生長、增殖中的關(guān)鍵作用，為揭示HBC參與肝癌發(fā)生的分子機(jī)制提供了直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2首次對HBC調(diào)控HTERT表達(dá)的分子機(jī)制進(jìn)行了深入研究，確定CETS2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)為HBC調(diào)控HTERT啟動(dòng)子活性的關(guān)鍵位點(diǎn)，并明確了CETS2蛋白核轉(zhuǎn)位在HBC上調(diào)HTERT表達(dá)中的關(guān)鍵作用，為HBC蛋白調(diào)控基因表達(dá)的通路研究提供了新的數(shù)據(jù)。

簡介：目的了解河北省不同地區(qū)、不同人群中肝炎病毒的感染狀況和流行趨勢，掌握其流行特征，分析該省人群中肝炎病毒的感染相關(guān)因素，評價(jià)人群乙肝疫苗接種效果，為乙肝的科學(xué)防控提供基礎(chǔ)。方法2011年在河北地區(qū)常駐人口中開展血清流行病學(xué)研究，運(yùn)用多階段整群系統(tǒng)隨機(jī)抽樣方法，隨機(jī)抽取22個(gè)縣區(qū)，按照系統(tǒng)抽樣法抽取縣區(qū)內(nèi)以家庭為單位的1～59歲居民，進(jìn)行問卷調(diào)查，并同時(shí)靜脈采血5ML。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA檢測血樣中乙肝病毒表面抗原HBSAG、乙肝病毒表面抗體抗HBS和乙肝病毒核心抗體抗HBC。利用EPIDATA310軟件對調(diào)查問卷及檢測結(jié)果進(jìn)行雙錄入，運(yùn)用EXCEL和EPIINFO軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析。結(jié)果1本次調(diào)查全省11個(gè)市的22個(gè)縣（區(qū)），共抽樣5072人，有流行病學(xué)調(diào)查資料和有實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果的有效樣本4567人，應(yīng)答率為9004％。調(diào)查城市人口2311人，農(nóng)村人口2256人，分別占調(diào)查總?cè)丝诘?060％和4940％。男、女性別比為1∶106。2全省1～59歲人群HBSAG、抗HBS、抗HBC分別為331％、4335％、2967％。其中HBSAG陽性率最高的廊坊499％，最低的是唐山127％石家莊抗HBS陽性率最高，為56％。3城鄉(xiāng)人群HBSAG陽性率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，農(nóng)村高于城市城市人群抗BS陽性率高于農(nóng)村，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義農(nóng)村人群抗HBC陽性率高于城市，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。41～4歲調(diào)查人群乙肝疫苗全程接種率和首針及時(shí)接種率分別為9405％、9405％，5～19歲調(diào)查人群乙肝疫苗全程接種率和首針及時(shí)接種率分別為7090％、5543％。年齡愈大，乙肝疫苗全程接種率和首針及時(shí)接種率愈低。5將14個(gè)因素與乙肝HBSAG陽性的關(guān)系通過用LOGISTIC回歸模型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)家庭有HBSAG陽性成員是影響乙肝感染的危險(xiǎn)因素。結(jié)論1河北省人群HBSAG陽性率為331％，與1992年調(diào)查的HBSAG陽性率相比，HBSAG陽性率明顯下降。按照世界衛(wèi)生組織分類標(biāo)準(zhǔn)，我省處于中流行區(qū)（8％＞HBSAG陽性率≥2％）。2河北省已經(jīng)實(shí)現(xiàn)2006～2010年全國乙型病毒性肝炎防治規(guī)劃全人群HBSAG陽性率將至7％以下的控制目標(biāo)。3河北省農(nóng)村地區(qū)HBSAG陽性率高于城市，15～29歲人群陽性率最高，以男性為主。4HBSAG陽性率與文化程度呈負(fù)相關(guān)不同民族HBSAG陽性率亦不相同。5乙肝疫苗接種已有大幅提高，低年齡組全程接種率及首針及時(shí)率農(nóng)村與城市已無差別。6通過用LOGISTIC回歸模型對調(diào)查的多種影響因素進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)家庭有HBSAG陽性成員是影響乙肝感染的危險(xiǎn)因素。7人群抗HBS陽性率水平較1992年明顯上升，乙肝疫苗接種已取得顯著效果。

簡介：分類號學(xué)號200878405學(xué)校代碼10487密級博士學(xué)位論文博士學(xué)位論文中國中國45歲以上歲以上人群人群首發(fā)卒中首發(fā)卒中后認(rèn)知障礙認(rèn)知障礙的調(diào)查的調(diào)查學(xué)位申請人張勇學(xué)科專業(yè)神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師張?zhí)I教授張振馨教授答辯日期2011年5月獨(dú)創(chuàng)性聲明獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明，本學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果的總結(jié)。盡我所知，除文中已經(jīng)標(biāo)明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。對本文的研究做出貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識到本人將承擔(dān)本聲明引起的一切法律后果。學(xué)位論文作者簽名日期年月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即學(xué)校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)華中科技大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密√□，在年解密后適用本授權(quán)書。本論文屬于不保密□。（請?jiān)谝陨戏娇騼?nèi)打“√”）學(xué)位論文作者簽名指導(dǎo)教師簽名日期年月日日期年月日

簡介：研究背景系統(tǒng)性紅斑狼瘡SLE是自身免疫介導(dǎo)的以慢性炎癥為突出表現(xiàn)的彌漫性結(jié)締組織病，以青年女性多見，可累及人體的多個(gè)器官系統(tǒng)，其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)是最重要的受累器官之一。SLE患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累，將發(fā)生一系列神經(jīng)精神癥狀，我們將其稱為神經(jīng)精神性狼瘡NPSLE。1999年，美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)ACR定義NPSLE是指在排除其它原因引起的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，由SLE引起的包括中樞、周圍和自主神經(jīng)系統(tǒng)的19種神經(jīng)精神癥狀。其中認(rèn)知功能障礙CI是19種精神神經(jīng)癥狀表現(xiàn)之一。據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，SLE患者認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率為21％80％不等，主要表現(xiàn)為注意力不集中、記憶困難、找詞困難、詞語不連貫等。在臨床上通常隱襲起病，許多患者病情穩(wěn)定，早期沒有明顯的精神神經(jīng)表現(xiàn)，多數(shù)為臨床醫(yī)生所忽略，直至病情嚴(yán)重如癡呆時(shí)才被診斷。也有學(xué)者認(rèn)為SLE患者存在認(rèn)知方面的障礙比所報(bào)道的還要高。目前SLE患者發(fā)生認(rèn)知功能障礙的機(jī)制還不完全清楚，普遍認(rèn)為可能與血管病變、血腦屏障破壞、抗神經(jīng)元抗體以及抗體對神經(jīng)元的直接破壞有關(guān)。并強(qiáng)調(diào)SLE患者早期認(rèn)知功能的損傷具有可逆性。所以，臨床上早期發(fā)現(xiàn)、診斷及經(jīng)過適當(dāng)?shù)闹委熓軗p的認(rèn)知功能，對病情的改善、預(yù)后都至關(guān)重要。近年來有較多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，超敏C反應(yīng)蛋白HSCRP水平與各種原因引起的認(rèn)知功能障礙存在明顯相關(guān)，推測原因可能是HSCRP對腦血管和神經(jīng)細(xì)胞起直接或間接的毒性作用。這些發(fā)現(xiàn)為臨床判斷認(rèn)知功能障礙提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，成為目前研究熱點(diǎn)，但其確切發(fā)生機(jī)理尚有爭論，需要進(jìn)一步深入研究。根椐目前有關(guān)資料，國外有關(guān)SLE患者認(rèn)知功能障礙與HSCRP的相關(guān)關(guān)系的研究報(bào)道不多，國內(nèi)至今也未見到相關(guān)研究報(bào)道。因此，探討國人HSCRP與SLE認(rèn)知功能障礙的關(guān)系，可為臨床上早期診斷、治療提供一定的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)，具有重要意義。研究目的探明我國系統(tǒng)性紅斑狼瘡女性患者血清HSCRP水平與認(rèn)知功能障礙之間的相關(guān)性，對臨床上早期診斷女性SLE患者認(rèn)知功能障礙，早期治療、改善預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。研究方法1選取女性SLE患者90例，填寫病例調(diào)查表，詳細(xì)記錄每位入選病例的一般情況，包括年齡，身高體重，文化程度，病程，目前治療情況，病情活動(dòng)度等。2對每位患者進(jìn)行蒙特利爾認(rèn)知功能評估MOCA北京版，并同步采集每位患者空腹靜脈血，檢測HSCRP水平及其他生化、免疫學(xué)指標(biāo)。3根據(jù)血清HSCRP水平進(jìn)行分組A組HSCRP正常組03MGL；B組HSCRP輕度升高組310MGL；C組HSCRP明顯升高組10MGL。4分析三組患者在年齡、文化程度、病程及病情活動(dòng)度、免疫學(xué)指標(biāo)方面的差異，并比較三組患者之間的認(rèn)知功能情況。5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法①計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差X±S描述。②獨(dú)立樣本比率的比較用X2檢驗(yàn)。③對多組正態(tài)分布資料應(yīng)用方差分析，偏峰分布資料應(yīng)用非參數(shù)檢驗(yàn)。④對多因素采用偏相關(guān)分析及多重線性回歸分析。⑤檢驗(yàn)水準(zhǔn)以P005。5病情活動(dòng)度血清HSCRP濃度水平與代表SLE的病情活動(dòng)度的SLEDAI評分之間不存在相關(guān)關(guān)系R0019，P0859。結(jié)論16889％SLE女性患者有不同程度的認(rèn)知功能障礙，主要表現(xiàn)在視空間與執(zhí)行功能、命名能力、注意力、記憶力及定向力方面。2血清HSCRP水平與SLE女性患者認(rèn)知功能障礙之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，可以作為評估SLE女性患者認(rèn)識功能障礙出現(xiàn)的一項(xiàng)參考指標(biāo)。3血清HSCRP水平與SLE女性患者血清中出現(xiàn)ANA、DSDNA、SM、SSA、SSB、RNP抗體、補(bǔ)體下降、血沉升高以及與SLE的病情活動(dòng)無相關(guān)關(guān)系。

簡介：目的通過檢測SD大鼠認(rèn)知功能損害模型血清中MMP9的表達(dá)及腦海馬區(qū)組織MMP9基因轉(zhuǎn)錄的改變情況；分析其對大鼠麻醉和手術(shù)后認(rèn)知功能損害的影響，并探討認(rèn)知功能損害模型中調(diào)控MMP9的表達(dá)信號通路。方法將SD大鼠水迷宮訓(xùn)練6天后隨機(jī)分為3組，對照組A組15只、麻醉組B組35只和手術(shù)組C組35只。大鼠自實(shí)驗(yàn)前一日禁食。A組腹部行布比卡因（濃度0125％，每只總量限30～50MG）浸潤麻醉。B組SD大鼠先行腹部布比卡因（濃度及用量同A組）浸潤麻醉后異氟醚基礎(chǔ)麻醉，再行氣管插管和機(jī)械通氣（1ML100G呼吸頻率為70110次MIN），濃度為2的異氟醚持續(xù)吸入麻醉2H。C組SD大鼠腹部先行布比卡因（濃度及用量同A組）浸潤麻醉，再行剖腹探查術(shù)，手術(shù)持續(xù)2H。分別在術(shù)前1D、術(shù)后1、3、5、7D利用翻轉(zhuǎn)的MRIS水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測其空間記憶和學(xué)習(xí)能力。測試完畢后分批處死大鼠，ELISA檢測不同時(shí)間段大鼠血清中MMP9表達(dá)的改變情況；提取大鼠腦海馬區(qū)組織總RNA，RTPCR檢測大鼠腦海馬區(qū)組織MMP9基因轉(zhuǎn)錄的改變情況；同時(shí)提取大鼠腦海馬區(qū)組織細(xì)胞核蛋白，WESTERNBLOT檢測海馬區(qū)組織細(xì)胞NFΚB的激活情況。結(jié)果MRIS水迷宮訓(xùn)練后，測量大鼠游行到達(dá)平臺的時(shí)間和距離，與第1D比較，訓(xùn)練后的大鼠每天游行時(shí)間和距離均縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P結(jié)論1麻醉與手術(shù)均可引起實(shí)驗(yàn)鼠認(rèn)知功能的損害，且手術(shù)較麻醉產(chǎn)生的不良影響更大；2麻醉與手術(shù)均可引起實(shí)驗(yàn)鼠血清MMP9濃度增高與腦海馬區(qū)組織MMP9的高表達(dá)，與麻醉組大鼠比，手術(shù)組大鼠血清與腦海馬區(qū)MMP9的表達(dá)更強(qiáng)烈，持續(xù)時(shí)間更長；3NFΚB在大鼠認(rèn)知功能損害的過程中可能發(fā)揮重要作用。

簡介：丙型肝炎病毒HCV所致的丙型肝炎HC是一種危害嚴(yán)重的傳染病，HCV感染呈世界性分布，在我國HCV感染者約有4000萬。為了控制HCV經(jīng)血液傳播，國家要求對獻(xiàn)血者進(jìn)行抗HCV的檢測。目前國內(nèi)外HCV抗體檢測試劑均已開發(fā)了三代產(chǎn)品。第三代ELISA檢測試劑的質(zhì)量，較前兩代均有了很大提高，但還存在一定程度的漏檢和假陽性，如何提高HCV抗體試劑的質(zhì)量仍是一個(gè)亟待解決的問題。在ELISA方法上，目前抗HCV檢測試劑均采用間接法，即用酶免疫標(biāo)記的抗人IGG為第二抗體，檢測血清中卜ICV抗體IGG。由于IGG抗體出現(xiàn)時(shí)間較晚，對早期感染易產(chǎn)生漏檢；同時(shí)，由于血清中非特異性物質(zhì)的吸附及類風(fēng)濕因子等干擾，容易產(chǎn)生假陽性反應(yīng)；另外，ELISA試劑盒使用的許多基因工程表達(dá)抗原都有融合末端，其抗原性可影響抗體檢測，有時(shí)也會(huì)產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。而雙抗原夾心法ELISA使用的試劑從根本上更換了酶結(jié)合物質(zhì)，使得試劑對受檢樣品的特異性大大提高；同時(shí)，雙抗原夾心法ELISA檢測的是總抗體，除IGG之外，還可以檢測到IGM、IGA等。在感染早期，由于IGM抗體比IGG出現(xiàn)早，雙抗原夾心法就可以縮短檢測的窗口期，因而此種方法檢測的敏感性高。應(yīng)用雙抗原夾心ELISA法來代替間接ELISA法，可以大大提高診斷試劑的敏感性與特異性，此法己在乙肝表面抗體、梅毒抗體、HLV抗體等的檢測中得到了成功的應(yīng)用，但在抗HCV的檢測中目前還處于研究階段。我們采用HCV15基因型嵌合NS4抗原代替單一基因型的NS4抗原，以減少由于HCV基因變異對檢測可能造成的影響；用融合六個(gè)組氨酸的抗原來包被酶標(biāo)板，用融合GST的抗原來作酶標(biāo)抗原，以消除融合末端對檢測的影響。通過這些改進(jìn)，本研究旨在建立一種敏感性高、特異性強(qiáng)的HCV雙抗原夾心ELISA檢測法，并初步探討其在HCV抗體檢測中的意義。本研究分為如下兩個(gè)部分一、HCV不同基因編碼區(qū)重組質(zhì)粒的構(gòu)建與重組抗原的表達(dá)和純化以能表達(dá)LITCVCE、NS3和NS4GST融合蛋白的三種重組質(zhì)粒CPGEX4T2、NS3PGEX4T2和NS4PGEX4T2為模板，分別構(gòu)建了能表達(dá)HCVCE、NS3和NS4HIS融合蛋白的另外三種重組表達(dá)質(zhì)粒CPET28AC、NS3PET28AC和NS4PET28AC；重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，各重組質(zhì)粒構(gòu)建成功；重組質(zhì)粒測序結(jié)果顯示，插入的片段大小及閱讀框架全部正確；從IPTG濃度、誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間與溫度三個(gè)方面對蛋白表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化用NTANI柱純化融合六個(gè)組氨酸的HCV重組抗原HC、HNS3和HNS4，用GLUTATHIONESEPHAROSE柱子純化融合GST的重組抗原GC、GNS3和GNS4最后經(jīng)SDSPAGE鑒定，純化到的六種HCV重組抗原純度均較高，經(jīng)蛋白定量測定后濃度分別為HC為135MGML尿素變性；GC為0812MGML；HNS3為114MGML；GNS3為131MGML；HNS4為328MGML尿素變性；GNS4為162MGML。二、HCV抗原的HRP標(biāo)記以及HCV抗體雙抗原夾心ELISA的建立與評價(jià)采用改良過碘酸鈉法，標(biāo)記了三種HCV重組抗原GC、GNS3和GNS4。使用已知抗HCV陽性混合血清和陰性混合血清，從包被抗原、酶標(biāo)記抗原二個(gè)方面進(jìn)行方陣滴定，建立了單片段抗原夾心ELISA。方陣滴定結(jié)果顯示，抗HCV的C抗體檢測時(shí)，包被抗原HC的濃度為30ΜGML，酶標(biāo)抗原GC稀釋度為13000；抗HCV的NS4抗體檢測時(shí)，包被抗原HNS4濃度為30ΜGML，酶標(biāo)抗原GNS4稀釋度為11000；抗HCV的NS3抗體檢測時(shí)，包被抗原HNS3濃度為30ΜGML，酶標(biāo)抗原GNS3稀釋度為11000。單片段夾心ELISA方陣滴定結(jié)果，可以得出的結(jié)論是酶標(biāo)抗原GC的工作稀釋度分別是GNS3、GNS4的三倍，而GNS3、GNS4工作稀釋度相同。用己知抗HCV陽性混合血清和陰性混合血清LOOUL孔；抗原HC、HNS3、HNS4按摩爾比1105的比例混合用作包被抗原；標(biāo)記后的抗原混合比例與包被抗原的混合比例相對應(yīng)，按1315根據(jù)單片段抗原夾心ELISA方陣滴定結(jié)果求得混合作第二抗原，重新方陣滴定，建立了雙抗原夾心ELISA。方陣滴定結(jié)果顯示，混合包被抗原工作濃度為50ΜGML，混合酶標(biāo)抗原的工作稀釋度為1200。同時(shí)，分別從包被緩沖液、聚苯乙烯微孔板、封閉液、酶標(biāo)抗原稀釋液、標(biāo)本稀釋度等方面，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件。用間接ELISA萬泰試劑與雙抗原夾心ELISA，同時(shí)檢測了收集自南京市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科的1968份血清標(biāo)本，其中有17份血清標(biāo)本在兩種檢測方法中檢測結(jié)果不相符，又用HCVRNA套式RTPCR檢測了這17份血清標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)14份間接法抗體陽性而雙抗原夾心法陰性的血清標(biāo)本中只有1份標(biāo)本的HCVRNA陽性，3份間接法陰性而夾心法陽性的血清標(biāo)本中有2份標(biāo)本的HCVRNA陽性。雙抗原夾心法與間接ELISA法總體符合率為991％；以兩種ELISA檢測抗HCV均陽性為HCV真陽性，而以兩種ELISA檢測抗HCV均陰性為真陰性，再結(jié)合套式RTPCR的結(jié)果，可以得出來自二院的這1968份血清標(biāo)本中，HCV的感染率為98％193P1968；本實(shí)驗(yàn)所建立的雙抗原夾心法ELISA與間接法ELISA北京萬泰的敏感性分別為994％和989％；特異性分別為999％和992％。此外，用套式RTPCR檢測了31份間接法與夾心ELISA法抗HCV均陽性的血清標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)有23份血清HCVRNA陽性，HCVRNA陽性率為742％2331，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于14份間接法抗體陽性而雙抗原夾心法陰性的血清標(biāo)本的陽性率71％114。提示間接法檢測抗HCVIGG可能存在一定比例的假陽性。綜上所述，我們建立的檢測HCV抗體的雙抗原夾心法ELISA具有較高的敏感性和特異性，有望用于臨床HCV感染的診斷和獻(xiàn)血員的篩選。

簡介：山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文慢病毒載體介導(dǎo)紅色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染人膀胱癌細(xì)胞的研究姓名宋濤申請學(xué)位級別碩士專業(yè)泌尿外科學(xué)指導(dǎo)教師楊曉峰20090501山西醫(yī)科大學(xué)七年制臨床醫(yī)學(xué)碩士專業(yè)學(xué)位論文THESTUDYOFTRANSFECTIONEXPERIMENTOFHUMANBLADDERCARCINOMACEL1MEDIATEDBYLENTIVIRALVECTORTAGGED‘T1RFPCARALNOMACEMECLLATECLDYENTLVLRAVECTORTAGGEDW111TGENEABSTRACTOBJECTIVETOSTUDYTHEPOSSIBILITYOFTHEREDFLUORESCENTPROTEINRFPGENEACTSASREPORTERGENEINLIVECELLS，WESPECIALLYCONSTRUCTTHERECOMBINATIONTHREEPLASMIDLENTIVIRALVECTORSTAGGEDWITHRFP，ANDTRANSFECTTHEHUMANBLADDERCARCINOMMERCELLBCC，T一24CELL1INEOBSERVETHERESULTAFTERTHETRANSFECTIONACCOMPLISHEDUNDERTHECONFOCALLASERFLUORESECENCEMICROSCOPYMETHODTOTRANSFECTTHE293TCEL1WITHTHEVIRALPACKAGINGCEL1BYUSINGTHERFPLENTIVIRUSRECOMBINATIONLVCMVRFPANDBOTHPHELPER10ANDPHELPER20VECTORSACCORDINGTOTHELIPOFECTAMINE2000METHODAFTERINCUBATINGTHEMFOR34DAYS，HARVESTANDREFINETHEVIRUSSOLUTIONFETCHTHESOLUTION，INGATHERANDCONCENTRATETHEVIRUSSOLUTIONPACKAGESOMEOFTHEMATTHETEMPERATUREOF一80℃FORLONGTERMSAVINGTHELEFTSOLUTIONWASLEFTFORTHETITERTESTBYTHEREALTIMEWAYORHOLEDILUTIONWAYCULTURETHET24CELL1INEIN96WELLPLATESANDVIRUSOFSPECIFICCONCENTRATIONINTHEAIRINCUBATORINDIFFERENTMOIPROPORTIONFOR72’96HOURSTOGROPETHEBESTCONDITIONFORTRANSFECTINGTRANSFECTTHETARGETCELLREPEATLYACCORDINGTHERESULTOFTHEPRETESTABOVEOBSERVETHECEL1SUNDERTHECONFOCALLASERF1UORESECENCEMICROSCOPYWITHTHE558NMEXCITINGWAVELENGTHAND583NMEMITINGWAVELENGTHIDENTIFYINGTHEEXPRESSIONOFRFPGENEANDTRANSFECTIONEFFICIENCYBYFLOWCYTOMETRYAFTERTHATCOCULTURETHET一24CELLANDTRANSFECTEDT一24CEL1TOOBSERVETHEIRGROWINGPROPERTYRESULTSUCCESSFULLYCONSTRUCTINGTHERECOMBINATIONOFTHREEPLASMIDLENTIVIRALVECTORSTAGGEDWITHRFPAFTERTRANSFECTINGTHECARCINOMACELL1INE，THECELL1INESTRONGLYEMITTHEREDFLUORESCENCEUNDERTHECONFOCALLASERF1UORESECENCEMICROSCOPYCONCLUSIONDSREDGENECANSUCCESSFULLYEXPRESSINT一24CELLINFORMOFTHREEPLASMIDLENTIVIRALVECTORS，SOTHELIVECARCINOMACELLSCANBEDIREDTLYVISUALIZEDBYTHECONFOCALLASERF1UORESECENCEMICROSCOPYVIATHEREDFLUORESECENTOFTRANSFECTEDCELLSTHEMSELVESITISSUGGESTEDTHATDSREDGENEBEAFAVOURABLEREPTORGENEANDSCREENINGMARKERIN1IVECELLSKEYWORDSREDFLUORESCENTPROTEINGENERECOMBINATIONTHREE。PLASMIDLENTIVIRAL2

簡介：流行性感冒是由流感病毒引起的發(fā)病率高，流行廣泛，傳播迅速的急性病毒性呼吸道疾病，因此抗流感病毒藥物的研究受到普遍的重視，現(xiàn)在廣泛使用的金剛烷胺、病毒唑等藥物毒副作用明顯，中醫(yī)藥及復(fù)方研究在防治流感方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢，有著廣闊的前景。本實(shí)驗(yàn)就板藍(lán)根提取液AA和A抗流感病毒作用作了初步的研究。藥物是由兩種與以往不同的工藝提取的，從雞胚實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩方面研究藥物抗流感病毒鼠肺適應(yīng)株FM1和增強(qiáng)免疫功能方面的作用。板藍(lán)根提取液AA雞胚實(shí)驗(yàn)先將藥物與病毒在體外作用1H后，再注射入雞胚。35℃培養(yǎng)3天后，收獲雞胚尿囊液，檢測尿囊液的血凝效價(jià)。板藍(lán)根提取液AA的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1藥物的抗病毒作用ICR小鼠70只，分為7組，每組10只，先提前灌胃給藥3天，灌胃劑量04ML只，3天后除藥物對照組外，各組小鼠在乙醚輕度麻醉下滴鼻給予病毒和生理鹽水，50ΜL只。連續(xù)給藥8天，觀察14天小鼠的死亡情況。2藥物的抗炎作用小鼠的給藥染毒方法同上。染毒第9天無菌解剖小鼠，取肺，做肺病理切片。3藥物對機(jī)體的免疫功能影響小鼠的給藥染毒方法同上，染毒第9天無菌解剖小鼠，取脾，同時(shí)做T、B淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。每組的小鼠留取血清用ELISA方法檢測細(xì)胞因子TNFΑ、IFNΓ、IL2。板藍(lán)根提取液A的實(shí)驗(yàn)方法同AA。雞胚實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，板藍(lán)根提取液AA和A能滅活流感病毒鼠肺適應(yīng)株FML。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示1經(jīng)板藍(lán)根提取液AA和A治療后的小鼠死亡率明顯降低，尤其是板藍(lán)根提取液AA和A的中、低劑量組的動(dòng)物死亡情況明顯好于病毒對照組；2由肺指數(shù)和病理切片分析得出板藍(lán)根提取液AA中劑量組和A低劑量組肺臟病變明顯減輕，抗炎作用較好；3由脾指數(shù)和T、B淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)分析得出板藍(lán)根提取液AA和A的中、低劑量組能促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)小鼠的免疫功能。4細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示小鼠致肺炎過程中，經(jīng)板藍(lán)根提取液治療后的小鼠血清中IFNΓ，IL2含量較病毒對照組高P005；TNFΑ含量較病毒對照組低P005。說明藥物具有一定的增強(qiáng)鼠免疫功能的作用。綜上所述板藍(lán)根提取液AA和A在體外能滅活病毒，在體內(nèi)具有一定的抗流感病毒鼠肺適應(yīng)株FM1、抗炎和增強(qiáng)鼠免疫功能的作用，尤其是板藍(lán)根提取液AA和A的中、低劑量的作用更加明顯。板藍(lán)根提取液AA和A雖然由兩種不同的工藝提取的，但兩者抗病毒和增強(qiáng)鼠免疫功能的作用差別不大。

簡介：天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文內(nèi)觀認(rèn)知療法對抑郁癥患者認(rèn)知偏差干預(yù)研究姓名侯筱菲申請學(xué)位級別碩士專業(yè)臨床醫(yī)學(xué)；精神病與精神衛(wèi)生學(xué)指導(dǎo)教師毛富強(qiáng)201205天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文持性心理治療。④受教育程度越低的抑郁癥患者越常產(chǎn)生自動(dòng)式思維。⑤內(nèi)觀認(rèn)知療法糾正抑郁癥患者歪曲認(rèn)知的療效與其受教育程度有關(guān)。⑥抑郁癥患者元認(rèn)知、自動(dòng)式思維、認(rèn)知偏差均與其抑郁程度相關(guān)。⑦內(nèi)觀認(rèn)知療法糾正患者認(rèn)知偏差的療效與其治療前抑郁程度相關(guān)。關(guān)鍵詞抑郁癥內(nèi)觀認(rèn)知療法元認(rèn)知自動(dòng)思維認(rèn)知偏差

簡介：本研究基金來源1中華兒科雜志第二屆雙鶴珂立蘇科研基金編號CJP0092四川省教育廳科研項(xiàng)目基金編號08ZAISO一0333四川省衛(wèi)生廳科研基金編號1103404瀘州市科技局瀘州市政府瀘州醫(yī)學(xué)院聯(lián)合專項(xiàng)資金編號2013LZLYJ08PINLSHRNA慢病毒載體的構(gòu)建及其對高氧誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響摘要目的PINL是人類肽基脯氨酰異構(gòu)酶，現(xiàn)在主要用于研究抑制腫瘤細(xì)胞的靶點(diǎn)。而目前研究發(fā)現(xiàn)，PINL參與氧化應(yīng)激通路，抑制其表達(dá)將可能減少高氧肺損傷，但具體作用機(jī)制研究鮮有報(bào)道。RNAI技術(shù)是目前公認(rèn)能夠快速有效的基因沉默方式，其可高效、特異性下調(diào)目標(biāo)基因的表達(dá)，研究基因功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，越來越受到人們的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建PINLSHRNA慢病毒載體，建立穩(wěn)定抑制肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶PINL表達(dá)的A549細(xì)胞系，從而探討PINL在氧化應(yīng)激通路介導(dǎo)高氧誘導(dǎo)人肺泡II型上皮A549細(xì)胞凋亡的影響，抑制其表達(dá)后是否對高氧誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞的保護(hù)作用。方法根據(jù)查閱文獻(xiàn)獲得PINLSHRNA干擾靶點(diǎn)序列并插入PLENRGPH載體，構(gòu)建PLENRGPHPINLSHRNA慢病毒載體，隨后轉(zhuǎn)入人胚腎HEK293T細(xì)胞中，收集其上清進(jìn)行病毒滴度測定，再行慢病毒的包裝，將獲得的慢病毒毒液感染A549。通過實(shí)時(shí)定量PCRQRTPCR及WESTERNBLOT法檢測PINL在不同組的表達(dá)抑制情況，最終獲得穩(wěn)定抑制PINL表達(dá)的A549PINLSHRNA細(xì)胞系。隨后將實(shí)驗(yàn)分為四組空氣組、高氧組、空載體組以及A549PINLSHRNA高氧組。高氧組、A549PINLSHRNA高氧組及空載體組均以高體積分?jǐn)?shù)氧高氧誘導(dǎo)細(xì)胞，即通入3L／MIN的90％氧氣和5％二氧化碳高純混合氣LOMIN，并在培養(yǎng)箱中密培養(yǎng)24H?？諝饨M則是含有10％胎牛血清和1％青鏈霉素的1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后收

簡介：研究背景乙型肝炎病毒感染是全球范圍內(nèi)影響人類健康的重大問題，我國是乙型肝炎高流行地區(qū)，全國一般人群HBSAG陽性率為909％，估計(jì)約12億人為慢性HBV感染，占全世界慢性HBV感染人數(shù)的131。目前人們對HBV及其所致疾病有了相當(dāng)深入的認(rèn)識，但由于缺乏合適的動(dòng)物模型及體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，乙型肝炎病毒的生物學(xué)研究和治療進(jìn)展緩慢26。現(xiàn)有用于研究HBV的細(xì)胞模型主要是人原代肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系，前者保留了分化肝細(xì)胞的重要細(xì)胞學(xué)特性，但其缺陷在于在體外培養(yǎng)幾天后開始出現(xiàn)肝細(xì)胞特殊形態(tài)的消失，并且失去了對HBV的感染和復(fù)制能力，因而限制了其應(yīng)用；而后者是通過轉(zhuǎn)染HBV基因組或添加化學(xué)試劑而非HBV自然感染的方式進(jìn)入到細(xì)胞中，因此不能用于HBV早期感染過程的研究。為此，本研究旨在通過將經(jīng)化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)產(chǎn)生次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶HGPRT基因突變的HEPG2細(xì)胞與未攜帶HBV的人原代肝細(xì)胞融合建立一新型細(xì)胞系，使其能夠自然感染HBV并能體外傳代培養(yǎng)，為HBV感染宿主細(xì)胞的早期機(jī)制的研究，以及病毒侵入人肝細(xì)胞后完整的復(fù)制過程的研究提供一個(gè)強(qiáng)有力的工具。目的建立一新型細(xì)胞株，使該細(xì)胞株既能自然感染HBV又能傳代培養(yǎng)，評價(jià)雜交細(xì)胞對HBV的自然感染能力。方法分離培養(yǎng)未攜帶HBV的人原代肝細(xì)胞，與誘導(dǎo)突變的HEPG2細(xì)胞進(jìn)行融合得雜交細(xì)胞，經(jīng)HAT培養(yǎng)基篩選，利用胰蛋白酶G顯帶技術(shù)鑒定所得細(xì)胞，用含HBV的慢性乙型肝炎患者血清感染雜交細(xì)胞（同時(shí)感染HEPG2作為對照），巢式PCR檢測感染后細(xì)胞內(nèi)HBVDNA合成及分泌情況及有無HBV復(fù)制中間產(chǎn)物HBVCCCDNA，間接免疫熒光檢測感染后細(xì)胞內(nèi)HBCAG的表達(dá)，電化學(xué)發(fā)光法檢測感染后細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBSAG和HBEAG。結(jié)果成功建立人原代肝細(xì)胞與HEPG2的雜交細(xì)胞，能體外傳代培養(yǎng)，染色體核型分析示雜交細(xì)胞染色體眾數(shù)為99條，證實(shí)為融合細(xì)胞，HBV感染后第4天起，雜交細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)上清中均能檢測到HBVDNA，HBV感染后第3天起，雜交細(xì)胞內(nèi)可以檢測到HBV的復(fù)制中間產(chǎn)物HBVCCCDNA，HBV感染后第4天起，雜交細(xì)胞胞漿及部分胞核內(nèi)HBCAG始終是陽性表達(dá)，間接免疫熒光染色呈胞漿彌漫性著色，電化學(xué)發(fā)光法檢測培養(yǎng)上清中HBSAG及HBEAG持續(xù)表達(dá)；而感染后的HEPG2細(xì)胞檢測結(jié)果均為陰性。結(jié)論成功建立了一個(gè)兼具有人原代肝細(xì)胞和HEPG2細(xì)胞遺傳特性的雜交細(xì)胞株，該雜交細(xì)胞株可以被慢性乙型肝炎患者血清中的HBV病毒自然感染，并能傳代培養(yǎng)，可以進(jìn)一步用作研究HBV感染的體外細(xì)胞模型。

簡介：南方醫(yī)科大學(xué)2011級碩士學(xué)位論文深圳地區(qū)獻(xiàn)血人群隱匿性乙型肝炎病毒感染特征分析CHARACTERIZATIONOFOCCULTHEPATITISBVIRUSINFECTIONINSHENZHENBLOODDONORS課題來源國家自然科學(xué)基金81071348和81371801學(xué)位申請導(dǎo)師姓專業(yè)名培養(yǎng)類培養(yǎng)層所在學(xué)人杜鵬名黎誠耀教授稱免疫學(xué)型學(xué)術(shù)型次碩士研究生院生物技術(shù)學(xué)院答辯委員會(huì)主席江麗芳教授答辯委員會(huì)委員江振友教授付涌水教授張桂紅教授張雁教授2014年3月14日廣州摘要最廣，我國北方地區(qū)以C基因型為優(yōu)勢株，南方地區(qū)B型最常見。OBI的發(fā)生與發(fā)展機(jī)制現(xiàn)在仍然不清楚，可能機(jī)制包括一HBSAG和抗HBS結(jié)合形成了免疫復(fù)合物；二變異體的形成影響了HBSAG編碼區(qū)S基因?qū)Α癆，’抗原決定簇的編碼；三與其它肝炎病毒合并感染可能影響了HBV的復(fù)制，減少了HBSAG的合成。HBSAG的檢測作為我國HBV檢測的唯一指標(biāo)，核酸檢沏LJNUCLEICACIDTEST，NAIT還沒有納入法定項(xiàng)目，輸血存在HBV窗口期感染和OBI感染的輸血?dú)堄囡L(fēng)險(xiǎn)，國內(nèi)對B、C型OBI的研究停留在起步階段，沒有詳細(xì)的OBI流行病學(xué)調(diào)查，關(guān)于B、C型OBI的分子生物學(xué)特性的分析也只有零星的報(bào)道，沒有進(jìn)行進(jìn)一步詳盡的研究，本課題對我國B、C型OBL分子生物學(xué)的研究具有重要意義1，調(diào)查我國深圳地區(qū)OBI的流行情況；2，探討我國B、C型OBI的分子生物學(xué)特征；3，為OBI基因型B和C的監(jiān)測與防控策略提供重要依據(jù)，改進(jìn)血液安全篩查方法；4，為OBI的臨床發(fā)生、發(fā)展和個(gè)性化治療方案提供理論指導(dǎo)。材料2010年4月2012年12月深圳市血液中心采集的310，167份無償獻(xiàn)血者標(biāo)本，其中初次獻(xiàn)血者114，761份，占37％，重復(fù)獻(xiàn)血者195，406份，占63％，所有標(biāo)本經(jīng)過表面抗原膠體金試紙與ALT羅氏干式生化分析儀初篩，然后進(jìn)行酶免法EIA法和多聯(lián)病毒核酸篩查技術(shù)檢測。方法1無償獻(xiàn)血者樣本經(jīng)進(jìn)口和國產(chǎn)兩種試劑進(jìn)行HBSAG的檢測，經(jīng)美國諾華公司的TIGRIS全自動(dòng)血液核酸檢測儀進(jìn)行三聯(lián)熒光病毒單人份檢測，使用化學(xué)發(fā)光法CMIA，雅培進(jìn)行HBSAG的確認(rèn)。2用QPCR方法進(jìn)行HBSAG／DNA樣本HBV病毒載量的測定。3對HBSAG／DNA樣本進(jìn)行基本核心啟動(dòng)子／前C區(qū)BCP／PC、HBV全基因、PRES／S區(qū)、S區(qū)、PREC／C區(qū)的巢式PCR的擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送公司測序。4從GENEBANK基因數(shù)據(jù)庫挑選我國B型和C型HBV野毒株作為OBI變異株的參考序列；使用MEGA軟件分析OBI的S區(qū)序列以確定基因型。5將OBI樣本全基因序列分為PRE。S／S、POL、X、PREC／C，每個(gè)區(qū)核苷酸翻譯成蛋白序列后和相應(yīng)基因型的野毒株進(jìn)行序列比對分析。6與野毒株基因序列比對，分析OBI毒株全基因序列調(diào)控元件變