茶樹(shù)花青素還原酶的酶學(xué)特性研究.pdf

1、兒茶素是茶樹(shù)的主要次生代謝產(chǎn)物,也是決定茶葉品質(zhì)及其健康功效的重要組分。茶樹(shù)花青素還原酶(CsANR)可以催化花青素轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的2,3-順式-黃烷-3-醇,它是決定茶樹(shù)兒茶素合成的直接酶類。作為原花青素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶,國(guó)內(nèi)外研究者及本課題組前期工作已經(jīng)對(duì)花青素還原酶基因及其酶學(xué)性質(zhì)有了初步研究,但是也發(fā)現(xiàn)了很多疑問(wèn)。
　　本文首先初步純化了茶樹(shù)鮮葉中和通過(guò)原核表達(dá)的CsANR蛋白,并采用C18柱和旋光異構(gòu)柱分離,結(jié)合HPL

2、C技術(shù),鑒定了兩種來(lái)源的ANR蛋白酶反應(yīng)產(chǎn)物的差異。其次,利用原核表達(dá)的重組ANR蛋白,比較了兩種重組ANR酶的酶學(xué)特性差異。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.為排除茶樹(shù)鮮葉中的氧化酶干擾,本文采取硫酸銨沉淀法,對(duì)CsANR酶進(jìn)行了初步純化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CsANR酶反應(yīng)產(chǎn)物更易于檢測(cè)。利用C18柱和旋光異構(gòu)柱分離,結(jié)合HPLC檢測(cè)技術(shù),對(duì)來(lái)自茶鮮葉的CsANR酶反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析,結(jié)果表明,以矢車(chē)菊色素(CYA)和飛燕草色素(D

3、EL)為底物時(shí),CsANR酶生成的主要產(chǎn)物分別是2,3-順式-黃烷-3-醇(-)EC和(-)EGC,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)2,3-反式-黃烷-3-醇產(chǎn)物C和GC的生成。
　　2.進(jìn)行了CsANR1和CsANR2的原核表達(dá)。利用鈷離子親和樹(shù)脂,對(duì)CsANR1和CsANR2融合蛋白進(jìn)行了分離純化,得到目的蛋白。利用C18柱和旋光異構(gòu)柱分離,結(jié)合HPLC檢測(cè)技術(shù),對(duì)CsANR1和CsANR2融合蛋白進(jìn)行酶活檢測(cè)及產(chǎn)物鑒定。結(jié)果顯示,以CYA為底物時(shí),

4、重組CsANR1或CsANR2酶生成的主要產(chǎn)物是(-)C和(+)EC;以DEL為底物時(shí),重組CsANR1或CsANR2酶生成的主要產(chǎn)物是EGC和GC。在NADP+存在的條件下,沒(méi)有檢測(cè)到重組CsANR具有催化(+)C和(-)EC之間相互的差向異構(gòu)作用。
　　以上結(jié)果提示,來(lái)自茶樹(shù)鮮葉的蛋白與原核表達(dá)的重組蛋白之間的酶反應(yīng)產(chǎn)物并不一致。
　　3、對(duì)重組CsANR1和CsANR2的酶學(xué)特性進(jìn)行研究分析。結(jié)果表明,CsANR1酶的

5、最適反應(yīng)溫度為40℃,最適pH值為6.5;CsANR2酶的最適反應(yīng)溫度為40℃,最適pH值為5.5。從底物特異性結(jié)果看,CsANR1酶以CYA為底物時(shí)的親和力高于DEL,但DEL的Kcat/Km值卻要高于CYA;而CsANR2酶以DEL為底物時(shí)的親和力高于CYA,且DEL的Kcat/Km值也高于CYA。此外,大多數(shù)金屬離子對(duì)兩種酶有抑制作用,特別是Hg2+,在1mM的濃度下兩種酶已完全失活。但Al3+在1mM濃度下卻對(duì)CsANR1酶有促