RNA去甲基化酶FTO抑制劑對小鼠精原細胞增殖的調(diào)控研究.pdf

1、精子發(fā)生包括精原細胞的增殖與分化，減數(shù)分裂和精子細胞的變形成熟等過程，受到轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白修飾和非編碼RNA等表觀調(diào)控因子調(diào)控。近期研究表明m6A是真核生物mRNA上最豐富的一種化學修飾，參與調(diào)控mRNA剪接，降解以及翻譯等代謝過程，從而調(diào)控基因的表達;另據(jù)報道，m6A修飾參與精子發(fā)生的調(diào)控。FTO作為第一個被發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶，通過調(diào)控m6A修飾水平參與調(diào)控脂肪細胞的分化，癌細胞的增殖。MA2作為甲氯芬那酸(meclofenami

2、c acid，MA)的乙酯形式，可以有效的競爭性結(jié)合到FTO的活性中心，從而抑制FTO的m6A去甲基化酶活性。為探究m6A修飾對精原細胞增殖的調(diào)控作用，本研究選擇小鼠B型精原細胞和初級精母細胞之間階段來源的GC-1spg細胞作為研究對象，采用western blot、qRT-PCR、細胞流式、EdU、m6A dot blot等方法研究m6A對GC-1spg細胞增殖的調(diào)控作用;此外，構(gòu)建雙熒光報告系統(tǒng)并驗證m6A報告質(zhì)粒的功能。獲得結(jié)果如

3、下：
　　1、MA2處理不影響FTO蛋白的表達，mRNA的m6A修飾水平在MA2處理后顯著上調(diào)，并且m6A修飾水平的增加與MA2處理濃度呈正相關。
　　2、MA2處理導致GC-1spg細胞活性的降低，多核細胞數(shù)目的增加，但是TUNEL陽性細胞比例沒有改變;同時，Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3，Bax和Bcl2的蛋白表達無顯著變化。
　　3、MA2處理GC-1spg細胞導致EdU陽性細胞比例

4、的下降，和增殖標記基因PCNA和ki67表達的下調(diào)。另外，MA2處理誘導GC-1spg細胞周期G1/S阻滯。
　　4、查詢在線數(shù)據(jù)庫(http://mirlab.sysu.edu.cn/rmbase/)得到含有m6A修飾的細胞周期調(diào)控基因;進一步的檢測表明MA2處理上調(diào)CDK8的表達，但是下調(diào)CDK1，CDK2,CDK7,CDK9和CDK12的mRNA表達。
　　5、針對CREBBP基因3'UTR區(qū)的3個m6A修飾位點成功構(gòu)

5、建了CREBBP-m6A報告系統(tǒng)，結(jié)果表明細胞中mCherry的熒光強度與m6A修飾水平呈負相關。構(gòu)建了CDK2基因3'UTR m6A修飾位點的熒光報告質(zhì)粒，并驗證了CDK23'UTR區(qū)的m6A修飾可以調(diào)控CDK2轉(zhuǎn)錄本的表達。
　　綜上，通過FTO抑制劑MA2處理GC-1spg細胞，增加精原細胞中mRNA的m6A修飾，并調(diào)節(jié)細胞周期調(diào)控基因的表達，進而誘導細胞周期G1/S阻滯，抑制細胞增殖。此外，建立了以CREBBP-m6A報告