去甲基化抑制劑和組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑對前列腺癌細(xì)胞株雌激素受體的影響.pdf

1、表觀遺傳學(xué)被描述為沒有DNA序列變化、可遺傳的表達(dá)改變。研究表明表觀遺傳學(xué)改變在腫瘤發(fā)生中扮演一個重要角色，腫瘤發(fā)生中的主要表觀遺傳學(xué)改變是抑癌基因發(fā)生DNA異常甲基化和染色質(zhì)中的組蛋白修飾。表遺傳改變也是一個致癌事件，但是與遺傳學(xué)改變不同的是，表遺傳學(xué)的改變是可逆的。通過使用DNA甲基化酶抑制劑和組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶(HADC)抑制劑可以使表遺傳靜止的基因恢復(fù)活性，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性表型或延緩腫瘤的進(jìn)展。表遺傳修飾可逆的特性提示它可作

2、為腫瘤患者進(jìn)行治療的靶標(biāo)。 DNA甲基化調(diào)節(jié)基表達(dá)及某些抑癌基因高甲基化失活與腫瘤發(fā)生相關(guān)的理論已得到廣泛認(rèn)同。DNA甲基化調(diào)節(jié)基因表達(dá)與組蛋白去乙酰化的作用密切相關(guān)。DNA甲基化可誘導(dǎo)局部組蛋白脫乙?；谷旧|(zhì)乙?；浇档?，且甲基化的序列可募集甲基CpG結(jié)合蛋白(MeCP)與組蛋白去乙酰化酶(HADC)復(fù)合物(MeCP—HADC)，發(fā)揮對基因表達(dá)的抑制作用。因DNA甲基化失表達(dá)的抑癌基因能否通過去甲基化制劑或/和HDAC

3、抑制劑的作用重新表達(dá)為本次研究的目的。 雌激素受體屬于配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子超家族的一員。分為二型，ERα和ERβ；ERα位于前列腺基底上皮細(xì)胞和基質(zhì)間隙，ERβ位于前列腺腺體上皮間隙，目前認(rèn)為雌激素對于前列腺上皮的作用是通過ERβ信號途徑。Pasquali等研究表明在前列腺癌中沒有發(fā)現(xiàn)ERβ表達(dá)。然而，Leav等報道ERβ在高級別發(fā)育異常中免疫活性減少，但在高級別腫瘤和轉(zhuǎn)移性前列腺癌中重新出現(xiàn)，進(jìn)而有人認(rèn)為同乳腺癌一樣，前列腺癌

4、中即使有表達(dá)的ERβ可能是野生型ERβ的變異體，ERβ具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長抑制的作用，其發(fā)生變異突變可能導(dǎo)致抗雌激素治療不敏感或使癌細(xì)胞更具侵襲性。而目前絕大多數(shù)免疫組化染色研究僅僅用一種ERβ抗體，難以區(qū)分其他各種ERβ亞型的蛋白表達(dá)情況。相關(guān)研究表明ERβ在大多數(shù)前列腺癌中表達(dá)缺失顯示ERβ可能是潛在的腫瘤抑制基因，可能是治療前列腺癌的理想目標(biāo)。 在前列腺癌細(xì)胞株與前列腺癌組織中廣泛存在雌激素受體(ER)基因的甲基化，甲基化的程

5、度與腫瘤病理級別呈正相關(guān)，與ER基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，雖然在前列腺增生組織中也存在ER甲基化，但明顯低于前列腺腫瘤。在前列腺癌中，目前可畿的一個使ER基因失活的原因就是ER基因啟動區(qū)域的CpG島甲基化，通過一些尚不明了的機(jī)制導(dǎo)致ER基因轉(zhuǎn)錄失活。 為了研究前列腺癌細(xì)胞中雌激素受體β的表達(dá)情況與DNA甲基化酶抑制劑和HDAC抑制劑的作用是否有關(guān)聯(lián)，本實驗通過DNA甲基化酶抑制劑5—雜氮—2’—脫氧胞苷(5’—aza—2’—deoxy

6、cytidine，5—AZAC)和HDAC抑制劑曲古抑霉素A(Trichostatin A，TSA)作用于前列腺癌細(xì)胞系Du145、PC—3和22RV，檢測細(xì)胞凋亡情況；應(yīng)用熒光實時定量PCR檢測細(xì)胞中雌激素受體β的表達(dá)情況，觀察其是否上調(diào)，為前列腺癌的臨床治療提供基礎(chǔ)。 方法: 一．材料與主要試劑 雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞Du145、PC—3和雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞22RV購于中科院上海細(xì)胞庫；5—雜氮—2

7、’—脫氧胞苷(美國Sigma公司)，曲古抑霉素A(美國Sigma公司)，RT-PCR試劑盒(Takara公司)，四甲基偶氮唑藍(lán)(美國Sigma公司)，二亞基亞礬(美國Sigma公司)，Trizol(美國Gibco公司)，SBRY—Green(天根)，Master—mix(天根)。 二．實驗方法 1.細(xì)胞培養(yǎng) Du145和22RV細(xì)胞以含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，PC—3以含10％胎牛血清的HAM/

8、F—12培養(yǎng)基于37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4d消化傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。 2.MTT檢測5—AZAC和TSA對前列腺癌細(xì)胞的影響 檢測不同藥物濃度的5—AZAC和TSA以及5—AZAC和TSA共同作用的前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞生存率。細(xì)胞生存率(％)=(實驗組A值—空白組A值)/(陰性對照組A值—空白組A值)×100％。實驗重復(fù)3次。 3.實時熒光定量PCR檢測5—AZAC和TSA作用后的

9、前列腺癌細(xì)胞雌激素受體β的表達(dá) 收集經(jīng)不同藥物處理或未處理的細(xì)胞，Trizol提取總RNA，應(yīng)用TaKaRa公司的RT-PCR試劑盒和SBRY—Green檢測雌激素受體β的表達(dá)。 4.統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.6軟件包進(jìn)行處理，取p<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果: MTT檢測發(fā)現(xiàn)5—AZAC和TSA處理后的前列腺癌細(xì)胞株生存率降低，在一定范圍內(nèi)隨著劑量的增高，前列腺癌細(xì)胞生存率降低

10、的越明顯；5—AZAC和TSA聯(lián)合作用時前列腺癌細(xì)胞的生存率最低。 實時熒光定量PCR顯示三種前列腺癌細(xì)胞經(jīng)過5—AZAC和TSA作用后，mRNA ERβ表達(dá)量增加，并且隨著藥物濃度的增大，mRNA ERβ表達(dá)量越多；5—AZAC和TSA聯(lián)合作用mRNA ERβ表達(dá)量比單獨作用都多出1倍左右。 結(jié)論: 5—AZAC和TSA對前列腺癌細(xì)胞的生長起抑制作用，在一定范圍內(nèi)隨著劑量的增高，對前列腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用越明