萍鄉(xiāng)紅鯽卵母細(xì)胞組化及ZP(zona pellucida)基因的分子特征和表達(dá)分析.pdf

1、萍鄉(xiāng)紅鯽( Pingxiang red-transparent crucian carp, Carassius auratus var.Pingxiangnensis,簡(jiǎn)寫(xiě)CaP),分布于中國(guó)江西省萍鄉(xiāng)地區(qū),是一種自然野生的三倍體鯽魚(yú)突變體,具有雌核發(fā)育和兩性生殖兩種方式。關(guān)于萍鄉(xiāng)紅鯽卵膜透明帶基因(Zona Pellucida genes of CaP,CaP_ZP)表達(dá)和調(diào)控的研究很少。本研究包括以下四個(gè)部分:
　　一,應(yīng)用細(xì)

2、胞化學(xué)方法研究了萍鄉(xiāng)紅鯽卵子發(fā)生過(guò)程中主要生物大分子的變化。從1時(shí)相卵母細(xì)胞發(fā)育到2時(shí)相卵母細(xì)胞,可見(jiàn)蛋白質(zhì)沉積。但過(guò)碘酸-雪夫反應(yīng)(Periodic acid Schiff,PAS反應(yīng))和蘇丹黑反應(yīng)為陰性。隨著卵母細(xì)胞的繼續(xù)發(fā)育,糖類(lèi)和脂類(lèi)在卵母細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)。結(jié)果顯示,成熟卵母細(xì)胞包含了大量蛋白質(zhì)、糖類(lèi)和脂類(lèi),為成功受精以及胚胎發(fā)育作好準(zhǔn)備。
　　二,利用蔗糖-尿素法來(lái)分離純化萍鄉(xiāng)紅鯽卵母細(xì)胞卵殼蛋白,SDS-PAGE膠分析顯示

3、位于40-70kDa的四條卵膜蛋白條帶分子量大小與已經(jīng)獲得的萍鄉(xiāng)紅鯽CaP_ZP2和CaP_ZP3基因cDNA序列推導(dǎo)的氨基酸是相符的。利用RACE-PCR的方法,從萍鄉(xiāng)紅鯽卵巢組織中,克隆出了CaP_ZP2基因cDNA全長(zhǎng)1682bp,包含了一個(gè)1584bp的開(kāi)放閱讀框,編碼527個(gè)氨基酸殘基。采用染色體步移方法,成簇的編碼CaP_ZP蛋白的三個(gè)CaP_ZP基因被克隆鑒定出。這三個(gè)CaP_ZP基因,CaP_ZP3.1,CaP_ZP2和

4、CaP_ZP3.2,位于一個(gè)10,855bp區(qū)域之內(nèi)。這三個(gè)CaP_ZP基因都包含8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子,外顯子長(zhǎng)度分別為1348bp,1638bp和1348bp。這三個(gè)CaP_ZP基因的外顯子和內(nèi)含子的基因組結(jié)構(gòu)是完全相同的,暗示這三個(gè)ZP基因可能來(lái)自共同的基因祖先。
　　三,本研究利用熒光定量PCR的方法,檢測(cè)了萍鄉(xiāng)紅鯽CaP_ZP2基因mRNA在心臟,肝臟,脾臟,腎臟,大腦和卵巢組織中的差異性表達(dá)。結(jié)果表明:CaP_ZP2基

5、因在肝臟中的表達(dá)量最低,卵巢組織中的表達(dá)量最高。卵巢中CaP_ZP2基因的表達(dá)水平大約是肝臟中的85,932倍。其他組織中,CaP_ZP2基因僅有微量的表達(dá)。利用熒光定量PCR技術(shù),進(jìn)一步檢測(cè)了CaP_ZP2和CaP_ZP3基因mRNA在卵巢組織不同發(fā)育階段中差異性表達(dá)。分析結(jié)果顯示,兩個(gè)CaP_ZP基因在4-8月齡早期發(fā)育的卵巢中表達(dá)水平較高,在9-12月齡晚期的卵巢中,表達(dá)水平急劇降低。原位雜交實(shí)驗(yàn)也證實(shí)CaP_ZP2基因在卵母細(xì)胞

6、發(fā)育的早期檢測(cè)到較強(qiáng)的雜交信號(hào),發(fā)育晚期雜交信號(hào)減弱。在卵巢發(fā)育的不同時(shí)期,這兩個(gè)基因具有相同的表達(dá)模式。
　　四、一段特殊的1097bp啟動(dòng)子序列被克隆,該序列是CaP_ZP2和CaP_ZP3.2基因的共用啟動(dòng)子序列。將該啟動(dòng)子序列從順?lè)捶较蛏喜迦氲叫揎椀膒AcGFP1-1載體中。質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染cos-7細(xì)胞系。在cos-7細(xì)胞中觀察到較強(qiáng)的GFP熒光信號(hào)。由此,我們鑒定出了一段特殊的啟動(dòng)子序列,該序列利用順?lè)捶较蛏舷嗤恼{(diào)控元件