NaCS-PDMDAAC生物微膠囊成囊特性及固定化法生產(chǎn)1，3-丙二醇的研究.pdf

1、生物微膠囊作為最常用的固定化活細胞技術，受人工器官、基因治療及生物化工等領域發(fā)展的推動，引起研究者的廣泛興趣。聚電解質成膜反應以其溫和快速的特點成為制備生物微膠囊的最重要方法。本文以纖維素硫酸鈉(NaCS)/聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDMDAAC)為聚電解質成囊反應的代表，提出了改變膠囊大小及膜特性的方法，研究了聚電解質成膜反應特性與聚電解質溶液特性之間的關系，并應用NaCS/PDMDAAC微膠囊固定化Candidakrusei和Kle

2、bsiellapneumoniae，最后通過二過程的串聯(lián)實現(xiàn)了葡萄糖到1,3-丙二醇的轉化。 首先，建立了可控制膠囊大小的氣流微囊發(fā)生器。該裝置通過調(diào)節(jié)氣速來控制液滴大小，進而控制膠囊的大小，可有效調(diào)節(jié)膠囊直徑在1.0mm到2.6mm之間，并建立了氣速大小與膠囊大小之間的關系式。 其次，在纖維素硫酸鈉(NaCS)—聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDMDAAC)膠囊體系的基礎上，通過引入羧甲基纖維素(CMC)，制備得到一種新型的

3、三組分CMC-NaCS/PDMDAAC膠囊。以開始收縮時間、直徑、膜厚和機械強度等宏觀特性為膠囊的考察對象，研究了不同反應物濃度、不同反應條件下，制備得到的CMC-NaCS/PDMDAAC膠囊的特性。以強度為衡量標準，CMC-NaCS/PDMDAAC膠囊的較優(yōu)的反應條件為：35-40g/LNaCS，6-8g/LCMC，60g/LPDMDAAC在25℃下反應30-40分鐘。并詳細研究了小分子物質(葡萄糖、甘油、酪氨酸和維生素B12)透過膠

4、囊的擴散特性，初步考察了膠囊穩(wěn)定性及菌的泄漏情況。 第三，在對CMC-NaCS/PDMDAAC膠囊研究的基礎上，詳細考察了添加其它類型物質(中性小分子、中性聚合物、小分子鹽)對NaCS/PDMDAAC體系膠囊的影響，并對影響方式進行了定性的分析。通過測定添加物對聚電解質稀溶液比濃粘度、Zeta電位，以及對聚電解質陰陽離子反應后懸濁液濁度、Zeta電位的影響，將稀溶液特性與制備膠囊過程關聯(lián)。提出了改善膠囊特性的二種方式：一是添加物

5、參與聚電解質體系的反應(如CMC引入NaCS/PDMDAAC體系)，二是添加物對聚電解質在溶液中的伸展特性要有強烈的影響(如PEG6000和NaCl引入NaCS/PDMDAAC體系)。 第四，應用NaCS/PDMDAAC微膠囊包埋產(chǎn)甘油耐高滲酵母Candidakrusei。通過研究滲透壓添加劑(NaCl、PEG4000、甘油)對酵母生長和產(chǎn)甘油特性的影響，發(fā)現(xiàn)胞外高滲環(huán)境會不同程度抑制酵母的生長，但是確實有利于甘油的生成。甘油作

6、為滲透壓調(diào)節(jié)劑效果最好，在初始甘油濃度為80g/L時，獲得的最高凈甘油濃度為99g/L(除去初始甘油濃度80g/L)，此時的甘油/葡萄糖轉化率為最大，達到55％，產(chǎn)率約為22gL-1Day-1。研究了NaCS/PDMDAAC生物微膠囊包埋Candidakrusei的培養(yǎng)過程中囊內(nèi)細胞濃度、囊內(nèi)外葡萄糖和甘油濃度隨培養(yǎng)時間的變化情況，發(fā)現(xiàn)由于傳遞問題使囊內(nèi)底物濃度偏低不能為細胞提供產(chǎn)甘油所需的高滲環(huán)境，結果導致普通包埋時細胞因周圍環(huán)境變化

7、而產(chǎn)生代謝遷移，出現(xiàn)二次生長的現(xiàn)象。提出了將高于細胞截留分子量的PEG4000包埋于NaCS/PDMDAAC膠囊中，為囊內(nèi)酵母C.krusei提供一個持續(xù)的局部高滲微環(huán)境的方法，與普通包埋相比不僅能夠大大縮短發(fā)酵的周期，而且最終甘油濃度亦提高25％左右，但是會有較高的殘?zhí)菨舛?。并且在氣升反應器中進行了五批次的實驗，獲得較穩(wěn)定的結果，甘油濃度為65g/L左右，甘油葡萄糖轉化率為0.35g/g左右，產(chǎn)率為21gL-1Day-1。 第

8、五，應用NaCS/PDMDAAC微膠囊包埋兼性厭氧的產(chǎn)1,3-丙二醇克雷伯肺炎桿菌Klebsiellapneumoniae。搖瓶發(fā)酵實驗中，經(jīng)12h發(fā)酵囊內(nèi)菌濃可達6g/L，而游離培養(yǎng)經(jīng)27h只有2.66g/L，表明微囊化細胞可獲得高密度細胞培養(yǎng)；并得到0.62mol/mol的1,3-丙二醇/甘油轉化率，高于游離培養(yǎng)的0.55mol/mol。由于膠囊膜對傳質的影響，使得囊內(nèi)甘油濃度在發(fā)酵過程中始終處于較低范圍內(nèi)，因此微膠囊固定化方法可以

9、有效避免Klebsiellapneumoniae發(fā)酵過程中的底物抑制問題。通過對不同初始甘油濃度(40g/L、60g/L、80g/L、120g/L)發(fā)酵結果的比較，固定床反應器批式發(fā)酵結果證實，K.pneumoniae經(jīng)包埋后囊外較高的初始底物濃度不會抑制囊內(nèi)菌的生長和1,3-丙二醇的生成，并能得到較高的1,3-丙二醇/甘油轉化率。在初始甘油濃度為120g/L時，最終1,3-丙二醇的濃度為63.1g/L，1,3-丙二醇/甘油轉化率和產(chǎn)率

10、分別高達0.65mol/mol、5.74gL-1h-1。在多批次補料研究時發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中不能及時排除的副產(chǎn)物乙醇的累積會導致發(fā)酵停止，更換新鮮培養(yǎng)基后發(fā)酵可繼續(xù)進行。在固定床反應器連續(xù)操作中，較低的稀釋率下1,3-丙二醇濃度和轉化率較高，但產(chǎn)率較低，而較高稀釋率下情況與之相反。 第六，通過串聯(lián)分別用微膠囊包埋的產(chǎn)甘油耐高滲酵母Candidakrusei和產(chǎn)1,3-丙二醇克雷伯肺炎桿菌Klebsiellapneumoniae，實