重組類人膠原蛋白Ⅰ的分離純化研究.pdf

1、本文主要研究重組類人膠原蛋白Ⅰ的基因工程下游工藝。將基因工程菌E·coliBL21經(jīng)高壓勻漿、硫酸銨鹽析、超濾濃縮后，得到類人膠原蛋白Ⅰ的粗品。再通過對離子交換批量層析與凝膠過濾層析相結(jié)合的方法和離子交換柱層析一步法進(jìn)行比較，得到了獲得高純度類人膠原蛋白Ⅰ的優(yōu)化工藝條件。主要工作： 1.粗提：采用高壓勻漿法破碎20分鐘，破碎率可達(dá)78.7％，破碎液中類人膠原蛋白濃度達(dá)2.56g/L；用飽和度范圍為20～50％的硫酸銨鹽析，采用L

2、9(34)正交表，經(jīng)方差分析確定鹽析條件為pH2.9，溫度18℃，蛋白濃度3g/L，鹽析后類人膠原蛋白純度達(dá)36.8％，回收率達(dá)92.7％。 2.純化：采用了兩種方法并進(jìn)行了對比。(1)離子交換批量層析與凝膠過濾層析相結(jié)合。采用批量層析的操作條件為：選用DEAE-52陰離子交換樹脂，用Tris-HCl緩沖液配置，在pH6.0、NaCl含量為0.2mol/L、蛋白進(jìn)樣濃度3g/L的條件下進(jìn)行批量層析，吸附時(shí)間為60min。收集吸附

3、后的上清液，經(jīng)SephadexG-100凝膠過濾層析柱，洗脫液為20mmol/LTris-HCl(pH7.5含20mmol/LNaCl)緩沖液?？色@得純度為97.6％的類人膠原蛋白Ⅰ，總回收率為63.0％。(2)離子交換柱層析一步純化法。經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定離子交換柱層析的實(shí)驗(yàn)條件為：類人膠原蛋白Ⅰ起始進(jìn)樣濃度為3g/L，以pH7.0、濃度為0.020mol/LNaCl含量為0.15mol/L的Tris-HCl溶液配制，然后在DEAE-52上以3

4、.0mL/min過柱吸附；再分別以pH為6.0，濃度為0.01mol/LNaCl含量為0.30mol/L的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行脫附，洗脫液體積為層析柱床層體積的12倍。可獲得純度為95.1％的類人膠原蛋白Ⅰ，總回收率為77.0％。純化后得到的類人膠原蛋白為卵清色液體，從SDS-PAGE電泳圖中可看出為單一條帶，并且分子量為97kD，與基因序列推導(dǎo)的一致。對N端15個(gè)氨基酸進(jìn)行測定的結(jié)果為NH2-H-D-P-V-L-Q-R-R-D-

5、W-E-N-P-G，與基因設(shè)計(jì)一致。 3.對離子交換批量層析和柱層析的動力學(xué)進(jìn)行了研究，最終得到的批量層析的液相溶質(zhì)濃度隨時(shí)間的變化表達(dá)式為：c=6.916e0.81t+13.664/9.1e0.81t-2.24；柱層析的穿透曲線模型為c/c0=1/2[1+erf(t/6-10)]。比較兩個(gè)模型所得的圖形與實(shí)測圖形表明模型與實(shí)測值吻合較好，采用零平均偏差分析對模型進(jìn)行了驗(yàn)證，模型的λ值均小于置信概率為99％時(shí)的Fm,n-1值，證