國(guó)產(chǎn)高聚物型色譜填料在高效液相色譜分離領(lǐng)域的應(yīng)用研究.pdf

1、聚苯乙烯型微米級(jí)微球不僅具有優(yōu)良的化學(xué)和機(jī)械穩(wěn)定性、易功能化、耐清洗和使用壽命長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，而且具有較高的分離效率，適宜作為高效液相色譜(HPLC)的分離材料，應(yīng)用于藥物和生化產(chǎn)品等物質(zhì)的分離分析。國(guó)外已有學(xué)者對(duì)此開(kāi)展了研究，國(guó)內(nèi)研究尚屬空白。
　　 本文用國(guó)產(chǎn)高聚物型色譜柱取代進(jìn)口色譜柱，研究其在有機(jī)酸發(fā)酵液、抗生素藥物和多肽分離分析中的應(yīng)用，為高聚物型填料在我國(guó)醫(yī)藥行業(yè)和生化領(lǐng)域下游分離純化過(guò)程中的發(fā)展積累經(jīng)驗(yàn)，具有重要的理論意

2、義和實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。
　　 國(guó)產(chǎn)粒徑單分散的聚苯乙烯－二乙烯基苯(PS-DVB)微球裝填的麥科菲反相高效液相色譜柱(MKF-RP)，克服了早期高聚物基質(zhì)在有機(jī)相中溶脹，柱壓陡增的缺點(diǎn)，而與硅膠基質(zhì)的性能相似，在有機(jī)相中柱壓呈有限的、規(guī)律性的變化。通過(guò)高效液相色譜分離5種芳香衍生物(苯酚、4－硝基苯甲醛、硝基苯、苯甲酸乙酯和甲苯)，評(píng)價(jià)了該MKF-RP色譜柱的分離性能。通過(guò)優(yōu)化得到最優(yōu)的色譜分離條件：MKF-RP柱(250mm×4

3、.6mmid.)；流動(dòng)相A液：水(20％)，流動(dòng)相B液：乙腈(80％)；流速：0.6mL·min-1；溫度：45℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nmUV。在MKF-RP色譜柱上，苯酚進(jìn)樣量在0.2μg～40μg的范圍內(nèi)有著良好的線性關(guān)系(r=0.9999)，重現(xiàn)性好，分析速度快且準(zhǔn)確。
　　 考查了以PS-DVB為基質(zhì)的麥科菲有機(jī)酸柱(MKF-YJS)在流速為0～3mL·min-1之間時(shí)，柱壓在0～250bar之間變化，柱壓與流速呈現(xiàn)很好的

4、線性關(guān)系，表明填料呈剛性且性狀穩(wěn)定。在MKF-YJS柱上，選擇了5種常見(jiàn)的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品(甲酸、L-乳酸、乙酸、琥珀酸和丙酸)進(jìn)行色譜條件優(yōu)化，得到最優(yōu)分離條件：色譜柱：MKF-YJS(250mm×4.6mmi.d.，5μm)；流動(dòng)相：A：0.02mol·L-1NH4H2PO4(磷酸溶液調(diào)pH至2.5)，B=乙腈，B=3％；流速：1.0 mL·min-1；溫度：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm。5種有機(jī)酸譜峰都可達(dá)到基線分離，對(duì)稱(chēng)性在1.06

5、-1.28之間，分離柱效均大于32000 Plates·m-1。在上述優(yōu)化色譜條件下，MKF-YJS柱能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)琥珀酸發(fā)酵液中9種成分的快速檢測(cè)。結(jié)果表明，在分離分析有機(jī)酸的應(yīng)用中，MKF-YJS柱相比較于鍵合硅膠柱及進(jìn)口有機(jī)酸柱，具有更優(yōu)良的性能及性?xún)r(jià)比。在MKF-YJS柱上，琥珀酸進(jìn)樣量在1μg～240μg之間，線性良好(r=0.9999)。琥珀酸的RSD為0.628％。最低檢測(cè)限和最大上樣量分別為0.7μg和240μg。發(fā)酵液中琥

6、珀酸平均回收率為91.76％。
　　 參照國(guó)外藥典，將MKF-RP色譜柱應(yīng)用于土霉素藥物的分離，克服了中國(guó)藥典采用的十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱所引起的色譜峰拖尾，柱效下降的缺點(diǎn)。通過(guò)優(yōu)化得到最優(yōu)色譜條件：色譜柱：MKF-RP(250mm×4.6mmi.d.)；流動(dòng)相：用200mL水，將45g2-甲基-2-丙醇移入1000mL的容量瓶中，再加入60mL、0.33mol-L-1的磷酸鹽緩沖液(pH7.5)，50mL、10g·L-1的

7、四丁基硫酸氫銨(預(yù)先用稀NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.5)和10mL、0.4g·L-1的乙二胺四乙酸鈉(預(yù)先用稀NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.5)，并用水稀釋至1000mL，過(guò)濾，脫氣；流速：1.0mL·min-1；溫度：60℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm。在優(yōu)化的色譜條件下，土霉素供試品和土霉素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC分離的各項(xiàng)參數(shù)均符合國(guó)外藥典的要求，分離柱效大于3000。土霉素進(jìn)樣量在0.1μg～2μg之間，線性良好(r=0.9996)，柱性能穩(wěn)定。土霉

8、素峰面積的RSD為0.13％。
　　 采用高聚物型PS-DVB麥科菲反相高效液相色譜柱(MKF-RP-MH)分離胸腺素α1，這類(lèi)疏水性基質(zhì)表面不含鍵合的烷基官能團(tuán)和殘留的硅羥基，不易產(chǎn)生不可逆的非特性吸附作用，克服了常用C18鍵合硅膠柱分離多肽的負(fù)面影響。優(yōu)化色譜條件為：流動(dòng)相A：0.01mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH7.0或8.0)，流動(dòng)相B：乙腈，梯度洗脫條件0～20min，0％～10％B，20～40min，10％～30％