枇杷赤霉素代謝途徑關(guān)鍵酶基因的克隆及表達(dá)初步分析.pdf

1、枇杷（Eriobotrya japonica Lindl）是薔薇科蘋(píng)果亞科枇杷屬植物，原產(chǎn)于中國(guó)。枇杷果實(shí)種子多并且種子相對(duì)較大，約占果實(shí)總重量的20％-30%，平均單果含有3-5粒種子，既影響食用的方便性，又不利于加工處置。因此無(wú)籽枇杷培育是枇杷育種的重要目標(biāo)之一。赤霉素是一種重要的植物激素，不僅參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)，還可以提高枇杷果實(shí)座果率。本研究以大五星二倍體及其三倍體A322株系為研究對(duì)象，測(cè)定了枇杷果實(shí)早期發(fā)育過(guò)程10種植物

2、激素的含量變化，采用同源基因克隆法克隆了枇杷赤霉素合成途徑中6個(gè)關(guān)鍵酶基因：GA20ox1，GA20ox2、GA3ox，GA2ox，CYP714A和CYP714C，并分析了這些關(guān)鍵酶基因在二倍體及三倍體枇杷A322株系果實(shí)早期發(fā)育中的表達(dá)特點(diǎn)。旨在從激素水平和分子水平探討赤霉素處理提高枇杷果實(shí)座果率的分子機(jī)理，為無(wú)籽枇杷生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)，主要試驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.枇杷果實(shí)發(fā)育期10種植物激素的測(cè)定
　?。?）以大五星和A3

3、22三倍體枇杷花和幼果為研究材料，建立了一套可同時(shí)分離和測(cè)定玉米素（ZT）、赤霉素（GA3）、激動(dòng)素（KT）、水楊酸（SA）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、苯甲酸（BA）、吲哚乙酸（IAA）、脫落酸（ABA）、吲哚丁酸（IBA）和茉莉酸（JA）10種植物激素方法。在以甲醇：乙腈：磷酸緩沖液（pH=3.0）體積比為20：20：60為流動(dòng)相，流速為1 mL/min，柱溫35℃，波長(zhǎng)為210 nm和254 nm的條件下，測(cè)定枇杷幼果中10種激

4、素，其線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)在0.9915以上，加標(biāo)回收率在58.6%-85.2%之間；檢測(cè)限在0.004-4.92 ng之間，精密度在0.026%-3.05%之間。此外，采用番茄和甘藍(lán)葉片對(duì)方法進(jìn)行了驗(yàn)證。
　?。?）枇杷果實(shí)發(fā)育過(guò)程中赤霉素（GA3）和水楊酸（SA）的含量較其他植物激素高；此外，在二倍體和三倍體中ABA均有兩個(gè)明顯的峰值，與落果時(shí)間一致。
　　2.枇杷赤霉素代謝途徑關(guān)鍵酶基因的克隆
　?。?）GA20ox1基

5、因cDNA序列全長(zhǎng)1083bp，與蘋(píng)果GA20ox1（XM_008344743）相似性為99%；GA20ox2基因cDNA片段長(zhǎng)1122bp，與蘋(píng)果GA20ox2（LOC103439689）相似性為98%；GA3ox基因cDNA片段長(zhǎng)931bp，與梨GA3ox（LC013247.1）相似性為98%，與蘋(píng)果GA3ox1（LOC103429342）相似性為98%；GA2ox基因cDNA全長(zhǎng)904bp，與梨GA2ox1（LOC10395733

6、2）相似性為98%；CYP714A基因cDNA片段長(zhǎng)797bp，與蘋(píng)果 CYP714A1（LOC103438620）相似性為99%；CYP714C基因cDNA全長(zhǎng)692bp，與蘋(píng)果CYP714C2（LOC103417797）相似性為97%，與梨CYP714C2（LOC103946398）相似性為96%。
　?。?）以同源基因克隆法得到的cDNA序列與本實(shí)驗(yàn)室枇杷轉(zhuǎn)錄組測(cè)序拼裝的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行本地blast分析，得到了3個(gè)目的基因c

7、DNA全長(zhǎng)序列和3個(gè)目的基因cDNA片段。3個(gè)全長(zhǎng)序列的cDNA目的基因分別為：GA20ox1、GA2ox和CYP714C；3個(gè)序列片段的cDNA目的基因分別為：GA20ox2、GA3ox和CYP714A。
　　3.枇杷赤霉素代謝途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)特性分析
　　根據(jù)激素測(cè)定結(jié)果選取大五星和A322株系開(kāi)花當(dāng)天（0d）和100 mg/L GA3、清水（含0.1%吐溫-80）和無(wú)處理后1d、3d、5d、15d、25d和30d各時(shí)

8、期的材料，qRT-PCR分析表明，赤霉素代謝途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)變化較大的為GA20ox1和GA3ox基因，其他基因表達(dá)變化不大。二倍體大五星GA20ox1基因表達(dá)GA3處理后30d表達(dá)量最高，處理后5d表達(dá)量最低。三倍體A322 GA20ox1基因表達(dá)開(kāi)花當(dāng)天表達(dá)量最高，此后1d至30d變化平穩(wěn)，30d增加不顯著。GA3ox基因在二倍體大五星中比在三倍體A322中表達(dá)變化較大。在大五星中，赤霉素處理后1d，達(dá)到最大值，此后表達(dá)量下降；在