柴達木盆地黑果枸杞F3′5′H基因啟動子克隆與活性分析.pdf

1、黑果枸杞主要分布于我國青海、寧夏、新疆等西部偏遠地區(qū)，是我國西北地區(qū)特有的保持水土和緩解土壤鹽堿化的理想植物。其黑色的果實中所含的大量花青素具有重要的醫(yī)療保健作用。類黃酮-3′，5′-羥化酶合成基因（F3′5′H基因）是合成使黑果枸杞果實呈黑色的矮牽牛色素的關鍵節(jié)點基因。為闡明F3′5′H基因的表達機理，明晰F3′5′H基因在黑果枸杞呈色中的作用，確定黑果枸杞及其白化果實中F3′5′H基因啟動子的活性，最終揭示黑果枸杞及其白化果實呈色差

2、異的原因。本研究以黑果枸杞果實為研究對象，以其白化果實為對照，首先確定了兩者中F3′5′H基因的表達模式，繼而克隆黑果枸杞果實F3′5′H基因全長cDNA序列，以該序列為模板，設計引物克隆兩者中F3′5′H基因的啟動子。將啟動子與GUS基因融合構建植物瞬時表達載體，利用農(nóng)桿菌介導的瞬時轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草葉片，煙草培養(yǎng)后進行組織化學染色以確定啟動子的啟動活性。結果如下：
　　1.利用實時熒光定量PCR（Real-time PCR）技術檢

3、測了F3′5′H基因在黑果枸杞及其白化果實中不同時期的表達模式，發(fā)現(xiàn)在S2-S5時期，其在黑果枸杞果實中的表達量明顯高于白化果實中的表達量。
　　2.利用RACE技術克隆得到長為1689bp的黑果枸杞F3′5′H基因的全長cDNA序列，其中包含長度為1527bp可編碼508個氨基酸的編碼區(qū)。對該全長cDNA序列及其編碼的氨基酸以及蛋白質(zhì)進行了生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)黑果枸杞F3′5′H基因的保守性較高，F(xiàn)3′5′H蛋白為非分泌蛋白，多

4、肽鏈內(nèi)部含有57個磷酸化位點，且蛋白為親水性蛋白。
　　3.利用Genome Walking Kit（TaKaRa）試劑盒通過3次染色體步移克隆出黑果枸杞及其白化果實F3′5′H基因的啟動子片段并測序。利用DNA MAN軟件分析發(fā)現(xiàn)2個啟動子序列的同源性高達90.3％，通過在線分析網(wǎng)站Plant Care對啟動子序列進行預測，發(fā)現(xiàn)兩者中均具有多個普遍存在于真核生物啟動子中的基本元件如TATA-Box及CAAT-Box。除此之外，還

5、有防御和脅迫應答元件TC-rich repeats、創(chuàng)傷響應元件WUN-motif以及多個與光響應相關的元件Sp1、Box I和G-box等。還存在一些其他類型的元件，如與胚乳表達相關的元件skin-1 motif和厭氧誘導元件ARE。另外在黑果枸杞啟動子中預測到與茉莉酸甲酯響應相關的元件TGACG-motif，而在黑果枸杞白化果實啟動子中沒有預測到。
　　4.分別將2個啟動子與GUS報告基因融合以構建植物瞬時表達載體，進而利用農(nóng)