藍(lán)紫色矮牽牛色素基因F3’5’H和DFR的克隆與植物轉(zhuǎn)化.pdf

1、目的：自然界中的花色種類(lèi)繁多,但是一些重要花卉都缺少藍(lán)色花品種,所以花色改良的研究工作-直是育種工作的重要目標(biāo)之一。在花色素苷代謝途徑中,類(lèi)黃酮3'5'羥基化酶F3'5'H是形成藍(lán)色花最關(guān)鍵的酶,能使花色素的合成趨向于藍(lán)色的飛燕草色素；二氫黃酮醇-4-還原酶DFR能特異地催化二氫黃酮醇還原成無(wú)色的花色素,對(duì)花色素苷的最終形成起決定性作用。F3'5'H基因作為藍(lán)色基因的重要組成部分之一,研究F3'5'H基因的表達(dá)可為今后利用基因工程技術(shù)改

2、良花色研究奠定基礎(chǔ)。 方法：本實(shí)驗(yàn)從藍(lán)紫色矮牽牛的花瓣中提取總RNA,利用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行F3'5'H cDNA片段和DFR cDNA片段的克隆。分別將F3'5'H基因和DFR基因連接到含有35S啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體pBI-121上,成功構(gòu)建植物表載體pBI-F3'5'H及pBI-DFR,并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)粉紅色品系矮牽牛進(jìn)行了F3'5'H基因的遺傳轉(zhuǎn)化。 結(jié)果：測(cè)序結(jié)果分析表明,克隆得到的F3'5'H基因的序列與N

3、CBI登錄的cDNA序列(D14588)相似性達(dá)到99.34％,開(kāi)放讀碼框?yàn)?521bp,編碼506個(gè)氨基酸。根據(jù)F3'5'H cDNA的測(cè)序結(jié)果推算氨基酸序列,并與NCBI登錄的氨基酸序列進(jìn)行分析比較,發(fā)現(xiàn)推算的氨基酸序列與已報(bào)道的存在2個(gè)氨基酸差異,氨基酸同源率為99.6％。DFR基因的編碼框長(zhǎng)度為1143 bp,與NCBI登錄的cDNA序列(X15537)相似性為99.39％,編碼380個(gè)氨基酸。根據(jù)DFR cDNA的測(cè)序結(jié)果推算

4、氨基酸序列,與NCBI登錄的氨基酸序列進(jìn)行分析比較,推算的氨基酸序列與已報(bào)道序列相似性達(dá)到100％。 實(shí)驗(yàn)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將F3'5'H基因轉(zhuǎn)化到粉紅矮牽牛中,通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR及RT-PCR鑒定,確定已獲得轉(zhuǎn)基因植株,下一步將在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究F3'5'H基因?qū)ㄉ挠绊?以期得到花色變異植株。 結(jié)論：本論文已從矮牽牛中成功克隆了花色素苷代謝途徑中編碼兩個(gè)關(guān)鍵性酶的F3'5'H和DFR基因,構(gòu)建了植物表達(dá)載體pB