酶催化合成D-異抗壞血酸脂肪酸酯的研究.pdf

1、隨著社會(huì)進(jìn)步、經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活水平的不斷提高，綠色、環(huán)保、營養(yǎng)、安全的食品抗氧化劑的研發(fā)日益受到重視。本文進(jìn)行酶催化合成 D-異抗壞血酸脂肪酸脂影響因素分析及工藝條件優(yōu)化、酶催化合成 D-異抗壞血酸脂肪酸脂反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、D-異抗壞血酸脂肪酸脂產(chǎn)品精制、檢測及抗氧化性能等基礎(chǔ)研究，具有重要的現(xiàn)實(shí)價(jià)值和理論意義。
　　以固定化脂肪酶Novozym435為催化劑，D-異抗壞血酸和癸酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸為原料，叔丁醇為溶劑，在45℃、2

2、00 r/min轉(zhuǎn)速下反應(yīng)12 h催化合成四種D-異抗壞血酸脂肪酸酯反應(yīng)產(chǎn)物。反應(yīng)體系中的D-異抗壞血酸采用高效液相色譜分析，建立定量標(biāo)準(zhǔn)方程，得到反應(yīng)轉(zhuǎn)化率計(jì)算方程，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)洗滌、萃取、重結(jié)晶得到 D-異抗壞血酸癸酸酯、D-異抗壞血酸月桂酸酯、D-異抗壞血酸棕櫚酸酯、D-異抗壞血酸硬脂酸酯四種精制產(chǎn)品，經(jīng)碘量法滴定分析，純度均達(dá)到95％以上，四種D-異抗壞血酸脂肪酸酯產(chǎn)品經(jīng)紫外吸收波譜、紅外光譜、質(zhì)譜及核磁共振氫

3、譜檢測分析，同理論一致。
　　采用單因素法實(shí)驗(yàn)考察了反應(yīng)溶劑、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、脂肪酶用量、D-異抗壞血酸濃度、底物摩爾比、4A分子篩用量及搖床轉(zhuǎn)速對酶催化合成 D-異抗壞血酸脂肪酸酯的影響。得到較佳的反應(yīng)條件為：反應(yīng)溶劑叔丁醇，反應(yīng)溫度45℃，合成 D-異抗壞血酸癸酸酯、D-異抗壞血酸月桂酸酯、D-異抗壞血酸棕櫚酸酯及D-異抗壞血酸硬脂酸酯的反應(yīng)時(shí)間分別為10、12、14、16 h，脂肪酶用量12.33 g/L，D-異抗壞血酸

4、濃度0.14 mol/L，底物摩爾比7:1，4A分子篩用量200 g/L，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。在較優(yōu)反應(yīng)條件下，酶催化合成D-異抗壞血酸癸酸酯、D-異抗壞血酸月桂酸酯、D-異抗壞血酸棕櫚酸酯及D-異抗壞血酸硬脂酸酯的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率分別為89.2%、88.9%、87.6%、86.8%。
　　采用響應(yīng)面法對酶催化合成 D-異抗壞血酸脂肪酸酯過程中的關(guān)鍵因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和研究，建立以反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為目標(biāo)函數(shù)的響應(yīng)面模型。預(yù)測出酶催化合成

5、D-異抗壞血酸脂肪酸酯優(yōu)化工藝條件，通過三批酶催化合成D-異抗壞血酸癸酸酯、D-異抗壞血酸月桂酸酯、D-異抗壞血酸棕櫚酸酯及D-異抗壞血酸硬脂酸酯的平行實(shí)驗(yàn)，所得反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的重復(fù)性較好，平均值分別為95.4%、94.4%、92.4%、90.6%，與模型的預(yù)測值吻合。
　　實(shí)驗(yàn)測得以癸酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸和 D-異抗壞血酸為反應(yīng)底物，在不同反應(yīng)溫度、不同底物濃度下酶催化合成 D-異抗壞血酸脂肪酸酯反應(yīng)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)采用

6、雙底物乒乓模型和具有底物抑制作用的雙底物乒乓模型擬合，建立了四種 D-異抗壞血酸脂肪酸酯酶催化合成反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，確定了模型參數(shù)及其與反應(yīng)溫度的關(guān)系。酶催化合成 D-異抗壞血酸脂肪酸酯反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律更符合具有底物抑制作用的雙底物乒乓模型。反應(yīng)過程中 D-異抗壞血酸與脂肪酶結(jié)合形成惰性復(fù)合體，對酶的活性有抑制作用。
　　通過清除自由基實(shí)驗(yàn)及氧化還原反應(yīng)實(shí)驗(yàn)測得 D-異抗壞血酸癸酸酯、D-異抗壞血酸月桂酸酯、D-異抗壞血酸棕櫚酸酯、D

7、-異抗壞血酸硬脂酸酯和D-異抗壞血酸、傳統(tǒng)抗氧化劑 BHT的羥自由基（?OH）清除率、二苯代苦味肼基自由基（DPPH?）清除率、超氧陰離子自由基（?O2-）清除率和還原能力。四種產(chǎn)品的?OH、?O2-、DPPH?清除率及還原能力隨產(chǎn)品濃度增大迅速增強(qiáng)。當(dāng)產(chǎn)品濃度達(dá)到3.0 mmol/L后，?OH清除率增速漸緩趨于穩(wěn)定；產(chǎn)品濃度超過0.10 mmol/L后，DPPH?的清除率高于90%，基本保持不變；產(chǎn)品濃度超過0.12 mmol/L后，