面向神經(jīng)再生的乳液靜電紡組織工程支架的制備研究.pdf

1、乳液靜電紡絲技術能制備出核殼結構的復合納米纖維，該纖維支架不但能模擬生物機體中的細胞外基質，為細胞生長提供黏附、支撐和引導，而且能實現(xiàn)對水溶性藥物、蛋白類和生物活性因子等功能性物質的擔載和保護作用；它能將藥物傳輸系統(tǒng)和組織工程支架材料的作用有效地結合起來，防止藥物、蛋白質或生長因子迅速消除/失活，且能在適當?shù)臅r間以可預測方式控釋/緩釋適宜劑量的藥物或生長因子，達到靶向抑制病原體或瘤細胞生長，或者刺激靶細胞生長和分化、促進組織修復和重建的

2、目的。但目前對于乳液靜電紡的研究大多集中在嘗試使用新的乳化劑、新的基底材料或者新藥物，雖然取得了一定的研究成果，但對于乳液參數(shù)是如何影響乳液靜電紡載藥納米纖維的理化性能和載藥/釋藥行為的研究鮮見。
　　為了更有效地利用乳液靜電紡絲技術，制備出理想的核殼結構載藥納米纖維組織工程支架，以應用于神經(jīng)再生研究，本文以乳液靜電紡絲技術為手段，通過對乳化劑的種類和比例、基底材料、水相溶質和水相/油相體積比等參數(shù)進行優(yōu)化篩選，制備出乳液靜電紡載

3、藥納米纖維，并對所得納米纖維的理化性能進行表征；然后將蛋白質和神經(jīng)生長因子分別擔載于乳液靜電紡納米纖維支架中，分析該支架的藥物釋放行為、考察其與細胞的生物相容性，探索該核殼結構載藥組織工程支架應用于周圍神經(jīng)損傷修復的可行性。課題的主要研究內容如下：
　?。ㄒ唬θ橐红o電紡中的重要參數(shù)——乳化劑的種類和濃度進行了篩選，以制備表觀形貌和理化性能良好的納米纖維。采用牛血清白蛋白（BSA）作為模型藥物，以聚己內酯（PCL）為基材，觀察四種

4、不同乳化劑：非離子型乳化劑山梨糖醇酐油酸酯（Span80）、陰離子型乳化劑十二烷基硫酸鈉（SDS）、陽離子型乳化劑芐基三乙基氯化銨（TEBAC）和 PEO-PPO-PEO（環(huán)氧乙烷環(huán)氧丙烷三嵌段共聚物） Pluronic F108對溶液性質、乳液靜電紡復合納米纖維形貌及理化性能的影響。通過單因素實驗法，篩選出了乳液靜電紡過程中最優(yōu)的乳化劑類型及其最優(yōu)濃度。溶液電導率測試結果表明：添加少量的離子型乳化劑TEBAC或 SDS能提高溶液的電導

5、率，非離子型乳化劑Span80或Pluronic F108的加入對溶液的電導率沒有影響；掃描電鏡觀察結果顯示，未加乳化劑時，低濃度PCL（8 wt％）基材與BSA粉末混紡制備出的纖維呈串珠狀或紡錘狀，當在上述溶液中加入少量（0.4%～1%）的乳化劑后，PCL溶液的可紡性提高，可紡出均勻、無串珠的納米級纖維。四種乳化劑中，以含0.4%（w/v）SDS的乳液紡出的纖維形貌最優(yōu)，平均直徑為167±39 nm，此歸因于其溶液的高電導率。含1%（

6、v/v）Span80的乳液制備的納米纖維的均勻性次之；水接觸角測量表明，除TEBAC外，其他三種乳化劑的加入均能顯著增加 PCL基納米纖維的親水性；隨著加入的乳化劑濃度的增加，PCL-BSA納米纖維的降解速度加快；差示掃描量熱分析顯示，所有的納米纖維表現(xiàn)出相似的熱力學特性，具有單一的吸熱峰，熔融溫度在60.1～65.3℃之間，純PCL納米纖維的熔融溫度為60.1℃，說明少量乳化劑的加入沒有明顯改變乳液電紡納米纖維的熱性能；傅里葉紅外光譜

7、沒有看到新的特征峰，表明添加的少量乳化劑與高聚物之間沒有形成新的化學鍵；納米纖維氈的力學拉伸實驗顯示：添加不同乳化劑的PCL-BSA復合納米纖維的力學性能各不相同，而含有0.4%（w/v）SDS的乳液制備的纖維膜具有最優(yōu)的斷裂強度和斷裂伸長率，含1%（v/v）Span80的乳液制備的納米纖維次之。上述結果提示：乳液靜電紡過程中，乳化劑的加入能改變紡絲液的電導率、影響乳液靜電紡納米纖維的直徑，調控復合納米纖維的表觀形貌和理化性能。通過采用

8、合適的乳化劑和乳化劑濃度，能夠在使用低濃度高聚物溶液條件下制備出形貌較優(yōu)、直徑均勻、理化性能良好的載藥復合納米纖維，有望應用在藥物釋放和組織工程領域。
　?。ǘ┻x用不同的高聚物作為基底材料（油相），以比較不同油相參數(shù)對乳液靜電紡載藥納米纖維的理化性能、載/釋藥行為及生物相容性的影響。為確保實驗結果具有普適性，選用鹽酸二甲雙胍（MH）和酒石酸美托洛爾（MPT）兩種水溶性藥物作為模型藥物，采用兩種分子量和理化性能不同的高聚物，即：聚

9、己內酯（PCL）和聚3-羥基丁酸-3-羥基戊酸共聚物（PHBV）作為基材，利用乳液靜電紡絲技術制備不同的載藥納米纖維膜，并對這些納米纖維膜的表觀形貌、熱力學特性、藥物釋放行為和生物相容性等進行系統(tǒng)研究。
　　掃描電鏡觀察結果和所測得的直徑數(shù)據(jù)顯示：①無論載藥與否，乳液靜電紡PCL基纖維總是比PHBV基纖維均勻纖細得多，這是由于PHBV本身的分子量遠大于PCL，且實驗中使用的PHBV的濃度幾乎是 PCL的兩倍；②載藥納米纖維的直徑比

10、純聚合物纖維的要細而勻，此因藥物的加入增加了溶液的電導率；③擔載MH的乳液靜電紡納米纖維的直徑比載有MPT的纖維直徑要均勻和細得多，這是因為鹽酸鹽類藥物MH溶液的電荷密度比酒石酸鹽類藥物MPT溶液的更高，使其在靜電紡絲過程中受到更大的靜電拉伸力，從而產(chǎn)生更細更勻的纖維。傅里葉轉換紅外光譜（FTIR）和差示掃描量熱分析（DSC）結果顯示：藥物、乳化劑和高聚物之間沒有形成新的化學鍵，少量藥物的存在不會對高聚物的熱力學性能造成影響。水接觸角測

11、試結果表明：由于乳液靜電紡 PCL載藥納米纖維的平均直徑遠小于同樣條件下制備的PHBV載藥納米纖維， PCL載藥納米纖維表面的乳化劑分子更多，使得其親水性能強于PHBV載藥納米纖維膜。體外藥物釋放研究顯示：與PCL載藥納米纖維相比， PHBV載藥納米纖維的藥物初期突釋更高，釋放速度更快，此歸因于PHBV和PCL兩者理化特性的差異。體外細胞毒性研究表明：乳液靜電紡載藥納米纖維對人骨髓間充質干細胞（hMSCs）無細胞毒性，擔載MPT的乳液靜

12、電紡PCL納米纖維膜比本研究中其它的纖維膜更有利于hMSCs的粘附和生長。上述結果提示：通過調節(jié)乳液的油相參數(shù)（高聚物基底材料），可以改變乳液靜電紡載藥納米纖維的理化性能和載藥/釋藥性能，PCL比PHBV更適合作為藥物緩釋/控釋體系的基底材料。
　?。ㄈ┥钊胙芯苛朔謩e包埋有水溶性小分子藥物和大分子蛋白質的復合納米纖維的表觀形貌和載藥/釋藥行為，以探索乳液中的水相參數(shù)性質和水相/油相（W/O）體積比對乳液靜電紡載藥納米纖維的理化性

13、能和載藥/釋藥行為的影響。將酒石酸美托洛爾（MPT）和牛血清白蛋白（BSA）分別作為小分子模型藥物和大分子模型蛋白質，以聚己內酯（PCL）為基材，設計單因素實驗，研究了水相溶質分子量、水相溶質濃度、水相/油相體積比對藥物的早期釋放的影響。
　　乳液穩(wěn)定性測試結果顯示：①添加有小分子藥物MPT的乳液的穩(wěn)定性比擔載BSA的乳液的差，這是因為MPT的水溶液的電離能力更強，不利于乳液的穩(wěn)定；②增加水相溶質的濃度和水相/油相體積比使乳液的穩(wěn)

14、定性降低，加快破乳速度。此因乳液是熱力學不穩(wěn)定體系，破乳是必然結果，但破乳的時間會因分散相濃度和體積的不同而異。
　　掃描電子顯微鏡觀察結果顯示：①水相溶質的分子量對乳液靜電紡載藥納米纖維的直徑幾乎無影響；②增加水相溶質的濃度，納米纖維直徑稍有增大但不明顯；③增加水相/油相體積比，納米纖維的平均直徑和直徑分布顯著增大，得到粗細不勻的分支粘連纖維。這是因為隨著水相體積的增大，乳液小液滴中H2O成分增多，而H2O本身不具有可紡性，因而

15、紡絲液的可紡性降低，所得納米纖維直徑增大；另外因為H2O的揮發(fā)速度遠小于有機溶劑，紡絲液中存在大量H2O使得纖維的干燥速度明顯變慢，纖維在到達接收裝置上時仍然濕潤，部分未完全干燥的纖維粘結在一起，形成纖維束，導致纖維粗細不勻。
　　藥物釋放實驗表明：①增加水相溶質的分子量對復合納米纖維的包封率幾乎無影響，但納米纖維的突釋顯著降低，這是因為較大的藥物顆粒將阻礙藥物的突釋和釋放；②無論增加水相溶質濃度還是水相/油相比例都會導致藥物早期

16、突釋的增大和藥物包封率的降低。首先，增加MPT和BSA在水相的濃度，即增加了電紡溶液的電荷密度，降低了乳液體系的穩(wěn)定性，并導致在電紡過程的中的射流鞭動不穩(wěn)定性的增加，藥物因為受到電荷斥力的作用，大量藥物分子被排斥到纖維表面或近表面，導致了藥物的突釋和藥物包封率的減少；其次，因為水相體積的增大，帶入更多的H2O，由于H2O本身不具備可紡性，紡絲液整體的可紡性降低，電紡過程的不穩(wěn)定性增加，從而導致突釋增加。此外，增大 W/O的比例也增加了乳

17、液體系的不穩(wěn)定性，從而無法制得理想的乳液靜電紡載藥納米纖維。該部分實驗結果表明，為了獲得理想的藥物釋放效果和較高的藥物包封率，應盡可能降低乳液的水相藥物濃度和水相/油相比例。雖然這樣會使得支架載藥量有所降低，但是靜電紡絲技術的最大優(yōu)勢即是在低的載藥量的條件下實現(xiàn)藥物利用效率的最大化。
　?。ㄋ模┰谇叭糠謱嶒灥幕A上，將生物活性大分子牛血清白蛋白（BSA）和神經(jīng)生長因子（NGF）雙組分成分包埋到納米纖維內部，制備擔載生物活性大分子

18、的乳液靜電紡復合納米纖維支架，并研究在乳液靜電紡過程中蛋白類大分子的生物活性保持度，以及 BSA和NGF在隨機排列（Random，R）和有序平行排列（Aligned，A）納米纖維中的釋放行為，同時選用大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤細胞（PC12細胞）檢測從納米纖維中釋放出來的NGF的生物活性。結果表明：所有的支架都具有良好的生物相容性，對 PC12細胞無毒性，但(R/A)-PCL-NGF和(R/A)-PCL-NGF&BSA納米纖維支架上有更多的細

19、胞生存，并有神經(jīng)突長出，提示從擔載NGF的納米纖維支架中持續(xù)釋放的少量 NGF依然具有生物活性，足以誘導 PC12細胞向神經(jīng)元樣細胞分化；有序PCL-NGF納米纖維能夠誘導PC12細胞長出更長的神經(jīng)突，并指導其神經(jīng)突沿著纖維的長軸定向生長，提示有序平行排列的納米纖維更有利于PC12細胞的粘附、分化和遷移；PC12細胞在載有NGF的納米纖維支架材料上的分化程度優(yōu)于在細胞培養(yǎng)液內直接加入外源性NGF的樣品，培養(yǎng)在A-PCL-NGF&BSA納