基因工程藥物制備的流程

1、 （二零一一年九月 二零一一年九月基因工程藥物制備的流程學(xué) 生 姓 名 ： 系 別 ： 專 業(yè) ： 班 級(jí) ： 指 導(dǎo) 教 師 ：學(xué)校代碼： 學(xué)校代碼： 10128 10128學(xué) 號(hào)： 號(hào)： 記確定電轉(zhuǎn)移是否成功。明確標(biāo)準(zhǔn)蛋白已從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素 膜后，將濾膜移入塑料袋， 按O．5ml／cm2加入含5％脫脂奶粉的PBS．T封閉液，封好，室溫封

2、閉l一2h。(3)抗原抗體反應(yīng)：將塑料袋剪一小口，棄去封閉液，按O．1ml／em2加入含有l(wèi)：500稀釋抗人EGF單克隆抗體或1：500兔抗人E40rf4抗血清的封閉液，室溫孵育1～2h或4。C過(guò)夜。取出濾膜，以TBS．T洗膜，10 min／次，三次。將濾膜 移入另一新塑料袋，加入用TBS—T稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠或羊抗兔IgG(1：2000)，室溫孵育I-2 h，TBS．T洗膜10rain／次，三次，TBS洗膜10rnin，一

3、次。(4)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)：以O(shè)．1ml／cmz將等體積的化學(xué)發(fā)光試劑A、B液混勻，滴在硝酸纖維素膜上5rain，將膜用保鮮膜包好，根據(jù)熒光強(qiáng)度，在X．光底片上分別做不同時(shí)間的曝光。曝光后的X．光片依次在顯影液、定影液中各浸泡3min。最后，將X．光片用清水沖洗，晾干。 6．融合蛋白EGF．E40rf4的純化采用FPLC系統(tǒng)進(jìn)行陰離子交換和凝膠過(guò)濾柱層析純化。陰離子交換層析柱：XK26，層析介質(zhì)：Q Sepharose Fast Fl

4、ow，柱體積50 Ild；凝膠過(guò)濾層析柱：Hi load16／60，層析介質(zhì)：Superdex75，柱體積120 ml。層析緩沖液見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方法部分。(1)樣品處理：酵母表達(dá)上清用0．22}tm的微孔濾膜過(guò)濾后經(jīng)截流分子量為50kD的膜包超濾濃縮，加入5倍體積BufferA稀釋，再次濃縮，重復(fù)4次左右。(2)陰離子交換層析：用5個(gè)柱體積的BufferA平衡介質(zhì)后，上樣，流速5 ml／min，用Buffer A將上樣峰洗至基線后，調(diào)整流速至

5、3 ml／min，先用bu脆r A和Buffer B進(jìn)行不同鹽濃度梯度洗脫，分管收集洗脫峰，SDS．PAGE蛋白電泳鑒定。(3)凝膠過(guò)濾層析：用2個(gè)柱體積的凝膠過(guò)濾緩沖液平衡介質(zhì)后，上樣，流速lml／min，用凝膠過(guò)濾緩沖液洗脫，分管收集洗脫峰，SDS．PAGE蛋白電泳鑒定。(4)純化蛋白處理：收集經(jīng)電泳鑒定后含有融合蛋白的洗脫液，10 kD超濾管 離心濃縮后用O．22岬濾膜過(guò)濾除菌，小量分裝，--20℃保存，并作蛋白定量(BCA 法

6、)。 7．蛋白定量(BCA法)(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用磷酸緩沖液配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，分別含有0，5，25， 50，125，250 lxg BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，終體積為1009l，加到96孔板上，每孔25vl，每個(gè)濃度設(shè)置三孔平行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加l 體積BCA試NB(50：1)配制適量，混勻后加入96孔板，每孔2001xl，60℃，30 min，A570比色，測(cè)定吸光度值，以蛋白含量為橫坐標(biāo)，A570值為縱坐