基因工程復(fù)習(xí)

1、基因工程復(fù)習(xí),一．基因工程的概念,由于基因工程是在ＤＮＡ分子水平上進(jìn)行操作,因此又叫做重組DNA技術(shù)。,生物體外,基因,分子水平,剪切→連接→導(dǎo)入→表達(dá),產(chǎn)生人類需要的基因產(chǎn)物,基因工程是指按照人們的愿望，將一種生物的基因在體外剪切，并與特殊的運(yùn)載工具進(jìn)行重新組合，然后轉(zhuǎn)入另一種生物的體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，并使之表達(dá)所需要蛋白質(zhì)的技術(shù)。通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，定向地改造生物的遺傳性狀。,二、基因工程的基本工具,（一）“分子手術(shù)刀”—

2、1．來源：主要是從 中分離純化出來的。2．功能：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的 斷開。3．結(jié)果：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式： 。,限制性內(nèi)切酶（簡稱限制酶）,原核生物,磷酸二酯鍵,黏性末端和平末端,,（二）“分子針線”——DNA連接

3、酶1．分類：根據(jù)酶的來源不同，可分為E·coli DNA連接酶和T4DNA連接酶兩類2．功能：恢復(fù)被限制酶切開了兩個(gè)DNA片段之間的磷酸二酯鍵。兩種DNA連接酶(E·coli DNA連接酶和T4DNA連接酶)的比較：①相同點(diǎn)：都縫合磷酸二酯鍵②區(qū)別： E·coli DNA連接酶來源于大腸桿菌，只能使黏性末端之間連接；T4DNA連接酶能縫合兩種末端，但連接平末端之間的效率較低。,DNA連接酶與D

4、NA聚合酶的比較,注意：解旋酶：能使DNA兩條鏈上堿基之間的氫鍵斷開，形成兩條單鏈。,（三）“分子運(yùn)輸車”——載體（1）作用：將目的基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)，利用載體在宿主細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。（2）載體具備的條件： ?有1~多個(gè)限制酶切點(diǎn)　 ?對(duì)受體細(xì)胞無害　　?導(dǎo)入基因能在受體細(xì)胞中復(fù)制、表達(dá)　　?有某些標(biāo)記基因，便于篩選。（3）最常用的載體是­­質(zhì)粒,它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨(dú)立于

5、細(xì)菌DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。（4）其它載體：λ噬菌體衍生物、某些動(dòng)植物病毒,,,,,1、目的基因的獲取,2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）,3、重組載體的導(dǎo)入和篩選,4、目的基因的表達(dá)與鑒定,三、基因工程的基本過程,三、基因工程的基本過程,第一步：目的基因的獲得1.目的基因是指：編碼蛋白質(zhì)的外源基因。2.原核基因采取直接分離法獲得，真核基因是人工合成法。人工合成目的基因的常用方法有反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法。

6、,①直接分離法（鳥槍法）：,供體細(xì)胞中的DNA,許多DNA片段,重組載體,限制酶,與載體連接,,,受體細(xì)胞,產(chǎn)生特定性狀,導(dǎo)入,外源DNA擴(kuò)增,,,目的基因,分離,,②反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，借助于反轉(zhuǎn)錄酶，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在ＤＮＡ聚合酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。,目的基因的mRNA,單鏈DNA(cDNA),反轉(zhuǎn)錄酶,,,DNA聚合酶,雙鏈DNA(目的基因),③化學(xué)合成法

7、 ：,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,目的基因的核苷酸序列,通過密碼子推測,利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則推測,,,目的基因,化學(xué)合成,,補(bǔ)充：PCR技術(shù),利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因（選修１—74頁）（1）PCR的含義：是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。（2）目的：獲取大量的目的基因（3）原理：DNA復(fù)制（4）過程：第一步：加熱至95℃，ＤＮＡ堿基對(duì)之間的氫鍵斷裂，DNA雙鏈拆開形成兩條單鏈——高溫變性；第二

8、步：冷卻到55 ℃ ，使一對(duì)引物分別與兩條單鏈DNA結(jié)合——低溫復(fù)性；第三步：加熱至7２℃，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）的催化作用下，形成兩條新的子鏈——中溫延伸。（5）特點(diǎn)：指數(shù)形式擴(kuò)增,1.目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。,標(biāo)記基因的作用：是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。常用的標(biāo)記基因是抗生素抗性基因。（人教P11頁）,2、方法

9、：同一種限制酶分別切割載體和目的基因，再用DNA連接酶把兩者連接。,第二步：重組載體的構(gòu)建（核心）,注意：重組載體重組成功的物質(zhì)基礎(chǔ)是：目的基因和載體（質(zhì)粒）的結(jié)構(gòu)組成相同。,思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？,不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。,第三步：重組載體的導(dǎo)入和篩選,轉(zhuǎn)化——,——顯微注射法,——用氯化鈣（Ca2+）處理,

10、目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程,受體細(xì)胞,穩(wěn)定,表達(dá),此方法的受體細(xì)胞多是受精卵,補(bǔ)充：感受態(tài)細(xì)胞：原核細(xì)胞經(jīng)過氯化鈣處理后，處于一種 能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。,受體細(xì)胞常選用原核生物為什么？,篩選出獲得目的基因的受體細(xì)胞、培養(yǎng)受體細(xì)胞并誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)1.首先要檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子雜交技術(shù)。2.其次

11、還要檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，方法是采用DNA—RNA分子雜交技術(shù)。3.最后檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是采用抗原—抗體雜交技術(shù)。4.有時(shí)還需進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定。如抗蟲或抗病的鑒定等。,第四步：目的基因的表達(dá)與鑒定,注意：１、目的基因成功表達(dá)的標(biāo)志是：轉(zhuǎn)基因生物合成了目的基因控制合成的蛋白質(zhì)，并顯示出目的基因控制的性狀。2、目的基因能在受體細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)是因?yàn)椋核猩锕灿靡惶酌艽a子。3、目的基因能與受體細(xì)胞基

12、因進(jìn)行重組是因?yàn)椋篋NA的基本組成單位和空間結(jié)構(gòu)相同。,與雜交育種和誘變育種相比，最突出的優(yōu)點(diǎn)是：目的性強(qiáng)、育種周期短，克服了遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，可以培育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)或具有特殊用途的動(dòng)植物品種。,四、基因工程育種的優(yōu)點(diǎn),五、基因工程的應(yīng)用,1、植物基因工程：抗蟲、抗病、抗逆轉(zhuǎn)基因植物，利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)。2、動(dòng)物基因工程：提高動(dòng)物生長速度來提高產(chǎn)品產(chǎn)量、改善產(chǎn)品品質(zhì)，用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物，用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作器官移植的供體等。,3、

13、基因診斷：是用放射性同位素（如32P）、熒光分子等標(biāo)記的DNA分子做探針，利用DNA分子雜交原理，鑒定被檢測標(biāo)本上的遺傳信息，從而達(dá)到檢測疾病的目的。 。4、基因治療：將正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導(dǎo)入靶細(xì)胞內(nèi)，糾正基因缺陷而達(dá)到治療疾病的目的。主要策略有基因置換、基因修復(fù)、基因增補(bǔ)、基因失活等。實(shí)例：基因如治療鐮刀型細(xì)胞貧血癥。,六、蛋白質(zhì)工程的概念、基本途徑,1、概念：蛋白質(zhì)工程是指根據(jù)蛋白質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)和生物活性之間的

14、關(guān)系，按照人類自身的需要，利用生物技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)的ＤＮＡ編碼序列或直接對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行有目的的改造，從而創(chuàng)造出自然界本不存在的、具有優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)分子。由于蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，在技術(shù)方面有許多和基因工程相似的地方，因此，蛋白質(zhì)工程也被稱為第二代基因工程。（而基因工程只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)）2、蛋白質(zhì)工程的實(shí)質(zhì)：根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，通過改造基因，以定向改造天然蛋白質(zhì)，甚至創(chuàng)造自然界不存在的、具有優(yōu)良

15、特性的蛋白質(zhì)。,3、蛋白質(zhì)工程的基本途徑預(yù)期蛋白質(zhì)功能→測定蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)→推測應(yīng)有的氨基酸序列→推測對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列→合成基因→通過轉(zhuǎn)錄、翻譯合成具有預(yù)期功能的蛋白質(zhì)。4、蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì)（1）小范圍內(nèi)改造：對(duì)已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行少數(shù)氨基酸的替換。（2）對(duì)不同來源的蛋白質(zhì)拼接組裝，期望轉(zhuǎn)移相應(yīng)的功能。（3）蛋白質(zhì)分子從頭設(shè)計(jì)：就是從氨基酸的排列順序出發(fā)，設(shè)計(jì)制造出自然界不存在的全新蛋白質(zhì)，使之具有特定的空間結(jié)構(gòu)和預(yù)期

16、功能。5、蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用（1）通過改造酶的結(jié)構(gòu)，提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性——T4溶菌酶（2）改變蛋白質(zhì)的活性——組織纖溶酶原激活物。（3）合成嵌合抗體——小鼠單克隆抗體和人抗體的結(jié)合。,七、蛋白質(zhì)工程與基因工程區(qū)別,例1 （08年全國卷理綜1）已知某種限制性內(nèi)切酶在一線性DNA分子上有3個(gè)酶切位點(diǎn)，如圖中箭頭所指，如果該線性DNA分子在3個(gè)酶切位點(diǎn)上都被該酶切斷，則會(huì)產(chǎn)生a、b、c、d四種不同長度的DNA片段?，F(xiàn)在多個(gè)上述線性DNA

17、分子，若在每個(gè)DNA分子上至少有1個(gè)酶切位點(diǎn)被該酶切斷，則從理論上講，經(jīng)該酶切后，這些線性DNA分子最多能產(chǎn)生長度不同的DNA片段種類數(shù)是 A.3 B.4 C.9 D. 12,解題思路:如果該線性DNA分子在3個(gè)酶切位點(diǎn)上都被該酶切斷，則會(huì)產(chǎn)生a、b、c、d四種不同長度的DNA片段；從其中二個(gè)切點(diǎn)進(jìn)行酶切，可得到不同于前面的片段種類有三種；只有一個(gè)切點(diǎn)，得到不同于前面的片段種類有二種。故最多能產(chǎn)

18、生片段種類4+3+2=9種。,例2（07年北京卷）利用外源基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，可生產(chǎn)人類所需要的產(chǎn)品。下列選項(xiàng)中能說明目的基因完成了在受體細(xì)胞中表達(dá)的是 A．棉花二倍體細(xì)胞中檢測到細(xì)菌的抗蟲基因 B．大腸桿菌中檢測到人胰島素基因及其mRNA C．山羊乳腺細(xì)胞中檢測到人生長激素DNA序列 D．酵母菌細(xì)胞中提取到人干擾素蛋白,答案：D （主要考查基因表達(dá)的基本概念，要有蛋白質(zhì)產(chǎn)品產(chǎn)生

19、，屬于性狀的表現(xiàn)。）,,3．(高考試題：2007全國理綜II)下列有關(guān)基因工程中限制內(nèi)切酶的描術(shù)，錯(cuò)誤的是A.一種限制性內(nèi)切酶只能識(shí)別一種特定的脫氧核苷酸序列B.限制性內(nèi)切酶的活性受溫度的影響C.限制性內(nèi)切酶能別和切割RNAD、限制性內(nèi)切酶可從原核生物中提取,,4、【生物－現(xiàn)代生物技術(shù)專題】為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后

20、，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的 處，DNA連接酶作用于 處。（填“a”或“b”）,,,（2） 將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和 法。,（3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用 技術(shù)。該技術(shù)的核心是 。（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是

21、否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的 作探針進(jìn)行分子雜交檢測，又要用 方法從個(gè)體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。,基因槍法（花粉管通道法）,植物組織培養(yǎng),去分化和再分化,耐鹽基因,一定濃度鹽水澆灌（移栽到鹽堿地中）,5．1979年，科學(xué)家將動(dòng)物體內(nèi)的能夠合成胰島素的基因與大腸桿菌的DNA分子重組，并且在大腸桿菌中表達(dá)成功。如右圖，請(qǐng)據(jù)圖回答問題。(1)此圖表示的是采取____

22、_ ___方法獲取_______________基因的過程。,人工（反轉(zhuǎn)錄）,胰島素目的基因,(2)圖中①DNA是以_____ ___為模板，_________形成單鏈DNA，在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得了所需要的基因。,胰島素mRNA,逆轉(zhuǎn)錄,(3)圖中②代表的是________酶，在它的作用下將質(zhì)粒切出理想的末端。(4)圖中③代表 DNA，含________基因。 (5)圖中④表示的過程是________

23、_ _________。,限制酶,重組,胰島素,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,6．(高考試題：2007山東理綜) 繼哺乳動(dòng)物乳腺發(fā)生器研發(fā)成功后，膀胱生物發(fā)生器的研究也取得了一定進(jìn)展。最近，科學(xué)家培養(yǎng)出一種轉(zhuǎn)基因小鼠，其膀胱上皮細(xì)胞可以合成人的生長激素并分泌到尿液中。請(qǐng)回答：（1）將人的生長激素基因?qū)胄∈笫荏w細(xì)胞，常用方法是___________。（2）進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移是，通常要將外源基因轉(zhuǎn)入___________中，原因是___

24、__________。（3）通常采用____ ___ 技術(shù)檢測外源基因是否插入了小鼠的基因組,顯微注射,受精卵,受精卵具有全能性，可使外源基因在相應(yīng)組織細(xì)胞表達(dá),DNA分子雜交,,7、豇豆對(duì)多種害蟲具有抗蟲能力，根本原因是豇豆體內(nèi)具有胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI基因)?？茖W(xué)家將其轉(zhuǎn)移到水稻體內(nèi)后，卻發(fā)現(xiàn)效果不理想，主要原因是CpTI蛋白質(zhì)的積累量不足。經(jīng)過在體外對(duì)CpTI基因進(jìn)行了修飾后，CpTI蛋白質(zhì)在水稻中的積累量就得到了提

25、高。修飾和表達(dá)過程如下圖所示：請(qǐng)根據(jù)以上材料，回答下列問題：,,(1)CpTI基因是該基因工程中的 基因，“信號(hào)肽，序列及“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)”序列的基本組成單位是 。,四種脫氧核苷酸,目的,在①過程中，首先要用 酶切開，暴露出 ，再用 酶連接。(2)在該基因工程中，供體細(xì)胞是 ，受體細(xì)胞是 。

26、(3)②過程稱為 。(4)檢測修飾后的CpTI基因是否表達(dá)的最好方法是 。,黏性末端,限制性內(nèi)切,水稻細(xì)胞,豇豆細(xì)胞,轉(zhuǎn)錄,讓多種害蟲吞食水稻葉片,（5）與雜交育種、誘變育種相比，通過基因工程來培育新品種的主要優(yōu)點(diǎn)是 和 。（6）當(dāng)前，轉(zhuǎn)基因大豆，轉(zhuǎn)基因棉花等已經(jīng)進(jìn)入了我們的生活。請(qǐng)你談?wù)勣D(zhuǎn)基因農(nóng)作物可能帶來的利與弊。（各一條