冷凍電鏡三維重構(gòu)

1、冷凍電鏡三維重構(gòu)2004.6冷凍電鏡三維重構(gòu)北京大學醫(yī)學部生物物理系北京大學醫(yī)學部生物物理系王佩榮王佩榮摘要：冷凍電子顯微學從創(chuàng)立到現(xiàn)在已發(fā)展成為確定蛋白質(zhì)分子，蛋白質(zhì)復合物和細胞器結(jié)構(gòu)的一種有效、的方法這表現(xiàn)在三位冷凍電鏡技術(shù)的不同方面。這主要包括適合于顯微鏡真空環(huán)境的樣品制備條件，減少輻射損傷的策略，提高未經(jīng)染色的電子顯微像的信躁比的方法和二位投影三位重構(gòu)的不同方法。冷凍電鏡通過高壓快速液氮冷凍的制樣方法能夠使樣品處在接近于生理環(huán)境

2、的玻璃態(tài)冰中從而保持其天然構(gòu)像，并且由于快速冷凍可以捕捉到某個反應過程的中間狀態(tài)從而可以對大分子復合物進行生物學功能的動態(tài)研究。確定三維結(jié)構(gòu)的方法主要有電子晶體學方法、單粒子重構(gòu)法和電子斷層成像技術(shù)。在主要的測定結(jié)構(gòu)的方法種，冷凍電鏡是唯一的能研究小到小的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)復合物大到細胞器甚至整個細胞的方法。關鍵詞：冷凍電鏡；三維重構(gòu)；單粒子法；斷層成像；電子晶體學引言引言在大量的基因序列被闡明后人們發(fā)現(xiàn)這還遠遠不能解釋復雜的生命活動，必須

3、對功能活動的執(zhí)行者基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)進行結(jié)構(gòu)和功能上的研究才能更好的理解生命過程。而以蛋白質(zhì)為主體的生物大分子的功能主要決定于它們的三維結(jié)構(gòu)。因此以Ｘ射線晶體學、核磁共振技術(shù)(ＮＭＲ)、電子顯微學和計算生物學為基本研究手段的結(jié)構(gòu)生物學將在其中扮演越來越重要的角色。Ｘ射線晶體學是目前分辨率最高的結(jié)構(gòu)測定方法，已經(jīng)非常成功地解析了大量單個分子的三維結(jié)構(gòu)。但是這種方法有一定的局限性：由于大分子復合物不易于形成三維晶體，很多疏水性蛋白也不易于

4、形成晶體，或者只有在去除一些柔性區(qū)域后才能形成好的三維晶體，這限制了Ｘ射線晶體學的應用范圍，另外由于晶格的約束干擾了對分子間相互作用，這并不利于對于蛋白質(zhì)的功能進行研究。NMR非常適合對水溶性的蛋白質(zhì)進行三維結(jié)構(gòu)測定，雖然也發(fā)展了一些新的技術(shù)如固相核磁共振（solidNMR）等可用于對小的膜蛋白的結(jié)構(gòu)測定，但需獲得在脂雙層上高度有序排列的樣品，而且分子量仍然是NMR的一個限制因素。二十世紀七十年代TaylK和GlaeserRM開創(chuàng)了冷凍

5、電子顯微術(shù)（cryoelectronmicroscopyCryoME）[1]，經(jīng)過近三十年的發(fā)展，冷凍電鏡技術(shù)已經(jīng)成為研究生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的強有力的手段。最近幾年冷凍電鏡的發(fā)展在研究大分子結(jié)構(gòu)上的分辨率已達到1015。雖然不及Ｘ射線晶體學但它具有許多獨特的優(yōu)勢：可以對均一的（如膜蛋白的二維晶體，二十面體對稱的病毒等對稱結(jié)構(gòu)）不均一的（如核糖體等）樣品用不同的方法進行三維結(jié)構(gòu)重構(gòu)，可以對生物大分子及其復合物或亞細胞結(jié)構(gòu)進行測定，使小到

6、蛋白質(zhì)大到真核細胞的三維結(jié)構(gòu)得以確定，分子量大小跨越了12個數(shù)量級。通過快速冷凍可以將樣品保存在生活狀態(tài)，其結(jié)構(gòu)更接近功能活性狀態(tài)；由于快速冷凍可以捕捉到反應過程的瞬時狀態(tài)從而易于進行時間分辨層面上的研究，從而對一些反應瞬時過程，和反應中間體進行研究，有助于對蛋白質(zhì)的動力學特性和功能的研究。三維冷凍電鏡技術(shù)將更完善的樣品制備方法，先進的儀器設備，更好的成像方法和強有力的數(shù)據(jù)處理和運算方法結(jié)合起來，使結(jié)構(gòu)測定的分辨率不斷得到提高。樣品制備

7、主要采用第1頁冷凍電鏡三維重構(gòu)2004.6的圖象來進行矯正和平均以增加SNR從而獲得結(jié)構(gòu)信息。場發(fā)射槍的應用提高了原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量，新的計算機軟件的應用使遠距離顯微操做和記錄成為可能。電子晶體學，單粒子法，電子斷層成像技術(shù)分別針對較小的對稱結(jié)構(gòu)，較大的不對襯結(jié)構(gòu)和更大的亞細胞結(jié)構(gòu)進行三維重構(gòu)和功能研。三種重構(gòu)方法的比較見圖1[3]1.冷凍電鏡單粒子法及其應用：冷凍電鏡單粒子法及其應用：三維冷凍電子顯微術(shù)已經(jīng)在確定結(jié)構(gòu)組成和大分子復合物的結(jié)

8、構(gòu)層次方面取得了重要進展。單粒子冷凍電鏡技術(shù)是獲得三位重構(gòu)圖像的重要的方法。單粒子法就是對分離純化的顆粒狀分子進行結(jié)構(gòu)分析。既可以對有二十面對稱結(jié)構(gòu)的病毒或螺旋對稱結(jié)構(gòu)進行分析，也可以對象核糖體等大的可溶性復合物進行結(jié)構(gòu)分析，還可以對溶解狀態(tài)的膜蛋白進行分析。其基本原理是通過對相同的生物大分子某方向的投影顯微像在時空中經(jīng)調(diào)整后進行疊加，從而提高信噪比，最后將不同投影方向的單顆粒顯微像在三維空間進行重構(gòu)獲得單顆粒大分子的三維結(jié)構(gòu)信息。主要

9、步驟可分為以下幾點：1、制備化學和結(jié)構(gòu)上均一的生物大分子的冰凍含水樣品，2、選擇最有可能能夠產(chǎn)生最佳圖像的最佳的顆粒密度和玻璃態(tài)冰厚度的樣品，3、設定最佳的參數(shù)（比如：欠焦值、放大倍數(shù)和電子劑量等）記錄這些樣品區(qū)域的大量圖像，4、用手工或半自動程序選擇那些離散的分子形成的投影圖，5、通過計算不同圖像之間的相對方位來重組出復合物的三維結(jié)構(gòu)模型。6、最后可以利用從晶體學或NMR獲得的結(jié)構(gòu)將原子坐標定位到密度圖中。為了使結(jié)構(gòu)的分辨率接近10或

10、更高，也可以對在分離的和圖1電子顯微學方法中三種研究對象和三維重構(gòu)方法。Missingcone(缺失錐)是指由于樣品傾轉(zhuǎn)角度范圍的限制使得倒易空間中有一個錐形區(qū)域的信息丟失。Fig.1thediagramillustrationofthreemethodsinelectronmicroscopy.Missingconemeanstheinfmationofaconeinthereciprocalspaceismissingduetoth