實(shí)驗(yàn)六tppa檢測梅毒螺旋體抗體和trust檢測反應(yīng)素ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)六 TPPA檢測梅毒螺旋體抗體和TRUST檢測反應(yīng)素,醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系臨床微生物免疫檢驗(yàn)教研室何應(yīng)中,一、目的及要求,掌握：凝集法的基本原理和TPPA檢測梅毒螺旋體抗體的 實(shí)驗(yàn)原理。 熟悉：TRUST檢測反應(yīng)素的原理，TPPA的操作方法和結(jié) 果判定。 了解：TRUST的操作及結(jié)果判斷，TPPA和TRUST的注意事 項(xiàng)及臨床意義。,二、基本概念,1.直接凝集反應(yīng)：細(xì)菌、螺旋體、紅細(xì)胞等顆?？?/p>

2、原，在適當(dāng)電解質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。 2.間接凝集反應(yīng)：先將可溶性抗原(或抗體)吸附于適當(dāng)大小的顆粒性載體表面，然后與相應(yīng)抗體(或抗原)反應(yīng)，在適當(dāng)電解質(zhì)參與下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象。,基本概念,凝集反應(yīng)是一種定性檢測方法，根據(jù)凝集現(xiàn)象出現(xiàn)與否判定結(jié)果是否陽性或陰性，但也可做半定量檢測，即將待測樣本作一系列倍比稀釋后進(jìn)行反應(yīng)，以出現(xiàn)凝集反應(yīng)的最高稀釋度為效價(jià)。,基本概念,梅毒螺旋體(treponema pa

3、llidum,TP)引起全身性慢性傳染病--梅毒，主要通過性交傳染。TP進(jìn)入人體后，可產(chǎn)生兩種抗體，一種是非特異性抗心擬脂抗體(又稱反應(yīng)素)，可用牛心擬脂檢測，稱非梅毒螺旋體抗原血清反應(yīng)；另一種是抗梅毒螺旋體抗體，可用梅毒螺旋體檢測出來，稱梅毒螺旋體抗原血清反應(yīng)。,,本次實(shí)驗(yàn)以梅毒螺旋體被動(dòng)顆粒凝集試驗(yàn)(treponema pallidum passive particle agglutination test，TPPA)檢測梅毒螺旋體

4、抗體和梅毒甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)(syphilis toluidine red untreated serum test，TRUST)檢測血清中的反應(yīng)素。,三、梅毒螺旋體被動(dòng)顆粒凝集試驗(yàn) (treponema pallidum passive particle agglutination test，TPPA)檢測梅毒螺旋體抗體,（一）實(shí)驗(yàn)原理,TPPA是將梅毒Treponema Pallidum(Nicho1s株)的精制菌體成

5、分包被在人工載體明膠粒子上。這種致敏粒子和樣品中的梅毒螺旋體(TP)抗體進(jìn)行反應(yīng)發(fā)生凝集，產(chǎn)生粒子凝集反應(yīng)(Particle Agglutination Test；PA法)，由此可以檢測出血清或血漿中的梅毒螺旋體(TP)抗體，并且可用來測定抗體效價(jià)。,（二）試劑和器材,1. 梅毒螺旋體抗體診斷試劑(凝集法) 包括溶解液、血清稀釋液、致敏明膠粒子(凍干粉)、未致敏粒子(凍干粉)、陽性對照血清等，有商品供應(yīng)。2. 待測血清 臨床篩選獲

6、得。3. 器材 U型微量反應(yīng)板、可調(diào)移液器(10～100μl, 100～1000μl)、加樣吸嘴、刻度滴管、25μl微量滴管、平板混合器、判定用觀察板等。,（三）操作方法,1．1％致敏粒子和1％未致敏粒子的配制：分別加入一定量的溶解液溶解混勻即可。請?jiān)谑褂们?0分鐘于室溫(15～30℃)下進(jìn)行配制。2．用移液器加入血清稀釋液100μl于U型微量反應(yīng)板第1孔中，從第2孔至第6孔各加入25μl。,操作方法,3．用移液器取樣本25μl至

7、第1孔中混勻，然后用移液器從第1孔吸取25μl于第2孔中混勻，再從第2孔中吸取25μl于第3孔中……依次類推，以2N的方式從第1孔稀釋至第6孔。4．用試劑盒中提供的滴管或移液器在第3孔中滴入1滴(25μl)未致敏粒子，從第4孔至第6孔各加入1滴(25μl)致敏粒子。,操作方法,5．用平板混合器(或用手輕輕撞擊敲動(dòng))以不會(huì)導(dǎo)致微量反應(yīng)板孔內(nèi)容物濺出的強(qiáng)度混合30秒鐘，加蓋后于室溫(15～30℃)下水平靜置2小時(shí)后或次日，在觀察鏡上記錄并

8、觀察其反應(yīng)圖像，或者利用免疫稀釋判定裝置進(jìn)行測定。見表3。,操作方法,表3 凝集法操作步驟Well No. 1 2 3 4 5 6血清稀釋液(ul) 100 25 25 25 25 25 待測血清(ul) 25 25 25

9、 25 25 25 25未致敏粒子(ul) 25致敏粒子(ul) 25 25 25最終稀釋倍數(shù) 1:40 1:80 1:160 1:320 混勻，加蓋后置室溫(15～30℃)水平靜置2小時(shí)或過夜

10、，觀察反應(yīng)判定結(jié)果,,,,,,,,,,,,,,,,,,,（四）結(jié)果判斷,1.反應(yīng)圖像判定 在判定用觀測板上靜置微量反應(yīng)板，觀察粒子的反應(yīng)圖像。將反應(yīng)圖像與介質(zhì)對照圖像進(jìn)行比較，并參照表4進(jìn)行判斷。,表4 凝集法反應(yīng)圖像判定 反應(yīng)圖像 判定粒子成紐扣狀聚集,呈現(xiàn)外周邊緣均勻且平滑的圓形 (－)粒子形成小環(huán)狀,呈現(xiàn)出外周邊緣均勻且平滑的圓形

11、 (±)粒子環(huán)明顯變大,外周邊緣不均勻且雜亂凝集在周圍 (＋)產(chǎn)生均一的凝集,凝集粒子在底部整體上呈膜狀延展 (++),結(jié)果判斷,,,,陽性：未致敏粒子最終稀釋倍數(shù)1:40的反應(yīng)圖像判定為 (－)，致敏粒子最終稀釋倍數(shù)1:80以上的反應(yīng)圖 像判定為(＋)，即最終判定為陽性，并將顯示反 應(yīng)圖像為(＋)的最高稀釋倍數(shù)作為抗體效價(jià)。陰性：無論未致敏粒子呈現(xiàn)何種反應(yīng)圖像，只

12、要致敏粒 子最終稀釋倍數(shù)1:80的反應(yīng)圖像顯示為(－)時(shí)， 最終判定為陰性。,結(jié)果判斷,2．結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn),可疑：未致敏粒子最終稀釋倍數(shù)1:40的反應(yīng)圖像判定為 (－)且致敏粒子最終稀釋倍數(shù)l:80的反應(yīng)圖像判 定為(±)時(shí)，最終判定為可疑。注意?。?！通過本試劑判定為抗體陽性或可疑的，經(jīng)過 一段時(shí)間再進(jìn)行復(fù)查，并與其他檢查結(jié)果和臨床 癥

13、狀結(jié)合起來加以綜合判斷。,結(jié)果判斷,（五）注意事項(xiàng),1.致敏粒子及未致敏粒子在使用前均應(yīng)充分混勻。2.試驗(yàn)在滴加致敏粒子后反應(yīng)板中液體須充分混勻后才能靜置。3.反應(yīng)靜置過程中，反應(yīng)板一定要加蓋并禁止振搖。4.用本試劑判定結(jié)果為可疑時(shí)，請使用其他檢查方法(FTA-ABS法等)。,5.本試劑用來測定樣品中的梅毒(TP)抗體效價(jià)，而不是直接用來測定TP。在判定為抗體陽性的情況下，請結(jié)合其他檢查結(jié)果及臨床癥狀進(jìn)行綜合判斷。6.應(yīng)注意血清

14、凝集法免疫反應(yīng)中可能發(fā)生的前帶現(xiàn)象。,注意事項(xiàng),7.TP感染初期，有可能不產(chǎn)生抗體，或產(chǎn)生抗體但數(shù)量很少的情況。如果已被懷疑為感染時(shí)，即使本試劑的判定結(jié)果為陰性，也要經(jīng)過一段時(shí)間再進(jìn)行檢查并與其他檢查(使用梅毒脂質(zhì)抗原進(jìn)行檢查，F(xiàn)TA-ABS試驗(yàn)等)結(jié)果和臨床癥狀結(jié)合起來加以綜合判斷。,注意事項(xiàng),8．服用含有免疫球蛋白血液制劑的患者樣品，有可能因服用制劑而呈陽性反應(yīng)，應(yīng)注意做出準(zhǔn)確判定。9．待測樣品可能存在HBV，HCV，HIV等，因

15、此對待測樣品及使用過的器具應(yīng)按二級(jí)實(shí)驗(yàn)室生物安全處理(用次氯酸鈉浸泡和＞121℃高壓蒸汽滅菌l小時(shí)以上)。,注意事項(xiàng),10.本試劑的溶解液、血清稀釋液和陽性對照血清含有疊氮鈉防腐劑。故在廢棄時(shí)要用大量水沖洗，以避免生成具有爆炸性的金屬疊氮。11.若發(fā)生試劑誤濺入口中或眼里，應(yīng)立即用大量清水沖洗，必要時(shí)到醫(yī)院就診。,注意事項(xiàng),四、梅毒甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn) (TRUST)檢測反應(yīng)素,（一）實(shí)驗(yàn)原理,用牛心擬脂抗原吸附于特制

16、甲苯胺紅上制成致敏粒子，當(dāng)這種致敏粒子與樣本血清作用時(shí)，若樣本中含有抗心擬脂抗體(反應(yīng)素)結(jié)合，形成肉眼可見的紅色凝集反應(yīng)。,（二）試劑和器材,1.梅毒甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)診斷試劑(TRUST) 包括TRUST抗原懸液、陰陽性對照血清、試驗(yàn)專用卡片、專用滴管及針頭。有商品供應(yīng)。2.0.9％生理鹽水。3.待測血清 臨床篩選獲得。4.器材 可調(diào)移液器(10～100μl)、加樣吸嘴、冰箱等。,（三）操作方法,1．定性試驗(yàn)(1)

17、分別吸取梅毒陽性對照、陰性對照和待檢血清或血 槳(不需滅活)50μl均勻鋪加于紙卡的三個(gè)圓圈中。(2)用專用滴管及針頭垂直分別滴加TRUST試劑1滴于上 述血清中。(3)按100r/min搖動(dòng)8min，肉眼觀察結(jié)果。,操作方法,2．定量試驗(yàn) 將待檢血清用生理鹽水作倍比稀釋，然后按上述定性方法進(jìn)行試驗(yàn)，以呈現(xiàn)明顯凝集反應(yīng)的最高稀釋度作為該血清的凝集效價(jià)。,（四）結(jié)果判斷,1.陽性反應(yīng)(+++～++++)：可見中等

18、或較大的紅色凝聚物。2.弱陽性反應(yīng)(+～++)：可見較小的紅色凝聚物。3.陰性反應(yīng)(－)：可見均勻的抗原顆粒而無凝聚物。,（五）注意事項(xiàng),1.本試驗(yàn)在23～29℃條件下進(jìn)行。2.TRUST試劑使用前應(yīng)充分搖勻。3.本試驗(yàn)系非特異性反應(yīng)，需結(jié)合臨床進(jìn)行綜合分析，必要時(shí)需作梅毒螺旋體抗體特異性試驗(yàn)。,五、實(shí)驗(yàn)討論與思考題,凝集反應(yīng)只有在抗原抗體比例適當(dāng)時(shí)，才能出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)。一般情況下，隨著血清濃度的逐漸稀釋，凝集反應(yīng)越來越弱，

19、但在抗體濃度過高時(shí)，反而無凝集現(xiàn)象出現(xiàn)，此為前帶現(xiàn)象。出現(xiàn)該情況時(shí)，須加大抗體稀釋倍數(shù)重新試驗(yàn)。,實(shí)驗(yàn)方法學(xué)評價(jià)：①由于抗原抗體反應(yīng)的血清學(xué)試驗(yàn)方法檢測靈敏度具有一定的局限性，所以本試劑檢測結(jié)果只能提示血清或血漿中有無TP抗體存在，而不能作為臨床診斷的唯一標(biāo)準(zhǔn)。②TP抗體檢測陰性的樣品并不能排除梅毒感染的可能。,實(shí)驗(yàn)討論與思考題,通過本試劑判定為TP抗體陽性或可疑時(shí)，需經(jīng)過一段時(shí)間再進(jìn)行復(fù)查，并與其他檢查結(jié)果和臨床癥狀結(jié)合起來加以綜

20、合判斷。1.TRUST和TPPA是否是特異性實(shí)驗(yàn)？為什么？2.TPPA陽性可以確診Treponema Pallidum嗎？TPPA陰性可以排除Treponema Pallidum診斷嗎？為什么？,實(shí)驗(yàn)討論與思考題,實(shí)驗(yàn)討論與思考題,3.直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)的概念是什么？4.何謂前帶現(xiàn)象？5.如何判定TPPA的結(jié)果？6.TPPA的注意事項(xiàng)是什么？7.Treponema Pallidum進(jìn)入人體后可產(chǎn)生哪幾種抗體？特異性如