兩種典型手性農(nóng)藥內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的對映體選擇性研究.pdf

1、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、家居生活中手性農(nóng)藥的廣泛使用，使其不可避免地進(jìn)入到環(huán)境系統(tǒng)、野生動(dòng)植物以及人體中。手性農(nóng)藥的各對映體在生物過程中存在著較大的差異性，故表現(xiàn)出不同的生態(tài)毒性。手性農(nóng)藥的使用與環(huán)境安全已成為一個(gè)全球關(guān)注的新問題。 目前環(huán)境領(lǐng)域關(guān)于手性農(nóng)藥的研究，大多集中于環(huán)境命運(yùn)、急性水生毒性等方面的對映體選擇性，但在內(nèi)分泌干擾方面的研究，少之又少。因此，我們選取兩種比較典型的手性農(nóng)藥——持久性有機(jī)污染物的重要成員o,p'-DDT及一種

2、目前廣泛使用的擬除蟲菊酯殺蟲劑聯(lián)苯菊酯(bifenthrin)為對象，在不同的體內(nèi)和體外模型中研究了它們類雌激素效應(yīng)的對映體選擇性差異。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對o,p'-DDT內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的對映體選擇性差異所造成的對人乳腺腫瘤和人類胎盤發(fā)生過程的影響的對映體選擇性進(jìn)行了研究，以探討手性化合物的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)可能導(dǎo)致的對人類健康影響的對映體選擇性差異及其機(jī)理。 在將這兩種手性農(nóng)藥成功拆分得到對映體純樣品的基礎(chǔ)上，我們主要研究了以下

3、四部分內(nèi)容： (1)選用雌激素依賴型的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系為研究模型，采用MCF-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(即E-SCREEN實(shí)驗(yàn))、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)等方法，評價(jià)了o,p'-DDT雌激素效應(yīng)的對映體選擇性。研究結(jié)果顯示：R-(-)-o,p'-DDT較S-(+)-o,p'-DDT能夠更顯著地刺激MCF-7細(xì)胞的增殖，同時(shí)，R-(-)-o,p'-DDT在誘導(dǎo)雌激素依賴型的報(bào)告基因pS2的表達(dá)上調(diào)與抑制雌激素受體α及β

4、(ERα、ERβ)基因表達(dá)等方面的效應(yīng)均高于S-(+)-o,p'-DDT。我們的研究結(jié)果表明，o,p'-DDT的類雌激素效應(yīng)具有明顯的對映體選擇性，R-(-)-o,p'-DDT的雌激素活性遠(yuǎn)高于S-(+)-o,p'-DDT，而且o,p'-DDT的類雌激素效應(yīng)與經(jīng)典的雌激素受體(ER)介導(dǎo)的信號(hào)通路有關(guān)。 (2)已有研究表明環(huán)境雌激素類化合物與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有一定的正相關(guān)性，而o,p'-DDT 是一種典型的環(huán)境雌激素物質(zhì)。在

5、評價(jià)了o,p'-DDT類雌激素效應(yīng)的對映體選擇性的基礎(chǔ)上，我們首次對o,p'-DDT對乳腺腫瘤影響的對映體選擇性進(jìn)行了研究。在人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系體外模型中，通過細(xì)胞間黏附分析實(shí)驗(yàn)、qRT-PCR檢測與乳腺腫瘤侵潤、黏附、增殖相關(guān)的MMP-9、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2、E-cadherin、β-catenin、hTERT等分子的mRNA表達(dá)情況，來初步探索o,p'-DDT影響乳腺腫瘤發(fā)展的對映體選擇性及其機(jī)理。研究結(jié)果

6、顯示：o,p'-DDT能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的侵潤能力，而這種作用與MMP-9、MMP-2分子表達(dá)的上調(diào)和細(xì)胞間黏附性降低有關(guān)。同時(shí)R-(-)-o,p'-DDT對細(xì)胞侵潤的促進(jìn)效應(yīng)高于S-(+)-o,p'-DDT。此外，細(xì)胞增殖的加快是腫瘤發(fā)展的一個(gè)明顯特征，我們的結(jié)果顯示o,p'-DDT的外消旋體及其對映體皆能夠上調(diào)端粒酶催化亞基hTERT基因的表達(dá)，且R-(-)-o,p'-DDT的誘導(dǎo)效應(yīng)顯著高于S-(+)-o,p'-DDT，這

7、是o,p'-DDT對映體對乳腺癌細(xì)胞增殖影響的可能機(jī)理之一。結(jié)合我們前面的研究結(jié)果，我們認(rèn)為o,p'-DDT雌激素效應(yīng)的對映體選擇性差異，可能是造成o,p'-DDT對乳腺癌影響具有選擇性的一個(gè)主要原因。 (3)人類胎盤發(fā)生過程是正常妊娠的重要生理保障。而胎盤的發(fā)生是一個(gè)受多種激素及其它因素精細(xì)調(diào)節(jié)的過程。目前關(guān)于環(huán)境雌激素是否能夠干擾這一過程的研究非常有限。我們以人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞系為研究模型，通過酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)(ELIS

8、A)測定孕酮分泌量及qRT-PCR檢測與人胎盤發(fā)生過程相關(guān)的PR、HILA-G、GnRH-Ⅰ及GnRHR-Ⅰ等分子的mRNA表達(dá)情況，來探討手性環(huán)境污染物(以o,p'-DDT為例)對人類生殖健康影響的對映體選擇性及機(jī)理。結(jié)果顯示：o,p'-DDT可以誘導(dǎo)絨毛膜癌細(xì)胞系JEG-3的孕酮激素分泌以及孕酮受體表達(dá)、上調(diào)妊娠免疫分子HILA-G的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)多肽類激素GnRH-I等的表達(dá)。以上效應(yīng)均表現(xiàn)出一致的對映體選擇性，即R-(-)-o,

9、p'-DDT對滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)分泌干擾的效應(yīng)高于S-(+)-o,p'-DDT。 以上(1)、(2)、(3)關(guān)于o,p'-DDT的研究結(jié)果表明，o,p'-DDT的類雌激素效應(yīng)具有明顯的對映體選擇性，而且這種選擇性在不同組織(人類乳腺、人類胎盤)中顯示出一致性，即R-(-)-o,p'-DDT 的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)總是高于S-(+)-o,p'-DDT。因此，在研究手性化合物雌激素效應(yīng)的對映體選擇性的同時(shí)，更要關(guān)注由此帶來的健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)中的一

10、系列與人類健康相關(guān)的問題。 (4)迄今為止，關(guān)于內(nèi)分泌干擾效應(yīng)方面的對映體選擇性的研究基本局限于o,p'-DDT及其類似物。已有的研究結(jié)果顯示，目前廣泛使用的擬除蟲菊酯類殺蟲劑，具有潛在的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，但在對映體水平上尚未見任何相關(guān)報(bào)道。 因此，我們選用當(dāng)前廣泛使用的擬除蟲菊酯殺蟲劑聯(lián)苯菊酯(bifenthrin, BF)為對象，來研究手性農(nóng)藥在擬雌激素效應(yīng)及體內(nèi)吸收方面的對映體差異性。以MCF-7細(xì)胞系作為體外實(shí)

11、驗(yàn)的模型，以及水生脊椎動(dòng)物日本青鳉魚(Japanese medaka，Oryzias latipes)作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯拷Y(jié)果顯示，1S-cis-BF較1R-cis-BF具有更強(qiáng)的雌激素活性。1S-cis-BF刺激MCF-7細(xì)胞增殖是1R-cis-BF的3.6倍，同時(shí)1S-cis-BF誘導(dǎo)雄性日本青鳉魚肝臟內(nèi)卵黃蛋白原(vitellogenin，VTG)的分泌效應(yīng)為1R-cis-BF的123倍。此外，在日本青鳉魚的肝臟及剔除肝臟的整個(gè)

12、魚體中，皆可以觀察到顯著的對映體選擇性吸收，1R-cis-BF的吸收量分別為1S-cis-BF的5倍(肝臟)、3倍(剔除肝臟的整個(gè)魚體)左右。 我國作為農(nóng)藥生產(chǎn)和使用的大國，手性農(nóng)藥的使用量占40％以上，而且這一比例還在不斷增長。同時(shí)，農(nóng)藥作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物已引起廣泛的關(guān)注。我們的研究結(jié)果再次說明，評價(jià)手性農(nóng)藥的環(huán)境安全性時(shí)，在考慮其急性毒性的同時(shí)、更要充分考慮其慢性生態(tài)毒性(如內(nèi)分泌干擾)的對映體選擇性，及由此造成的對人類