毒死蜱降解菌玫瑰紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)HW-D3菌株遺傳轉(zhuǎn)化方法的研究.pdf

1、有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱是一種具有顯著環(huán)境毒性的化學(xué)物質(zhì)，目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中用量很大。玫瑰紅紅球菌（Rhodococcus thodochrous） HW-D3菌株可高效降解毒死蜱，是毒死蜱污染生物修復(fù)的優(yōu)良菌株，可用于基因工程菌構(gòu)建的研究。本實(shí)驗(yàn)獲得以下主要研究結(jié)果。
　　 1．采用抗生素梯度平板法，測(cè)定了HW-D3菌株對(duì)常用抗生素的抗性。Chl、Km、Tc、Str、Ery、Amp和Neo對(duì)HW-D3菌株的最低抑制濃度（MIC）分別為：

2、10μg/mL、3μg/mL、3μg/mL、0.5μg/mL、0.5μg/mL、4μg/mL、3μg/mL。HW-D3菌株在含30μg/mL Chl的LB培養(yǎng)基上可以生長(zhǎng)但比較緩慢，對(duì)Km、Tc、Str、Ery、Amp和Neo六種常用抗生素比較敏感。幾種抗生素都可以作為HW-D3菌株遺傳轉(zhuǎn)化的篩選壓力。
　　 2．測(cè)定了HW-D3菌株的生長(zhǎng)曲線和降解活性，0～12h為HW-D3菌株的延緩期，12～24 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，之后進(jìn)入穩(wěn)

3、定期和衰亡期。培養(yǎng)48h時(shí)HW-D3菌株對(duì)毒死蜱的降解活性達(dá)到最高，而在細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的對(duì)數(shù)期活性較低。
　　 3．HW-D3菌株有一定的自養(yǎng)能力．高濃度的毒死蜱會(huì)抑制HW-D3菌株的生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)水解圈等適合作為遺傳轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記的菌落特征。
　　 4．采用堿裂解法中量提取HW-D3菌株的質(zhì)粒DNA。HW-D3菌株細(xì)胞中有一個(gè)分子量約15kb的質(zhì)粒，拷貝數(shù)較少，不易于分子生物學(xué)操作，不適合用于構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化載體。為降低載

4、體構(gòu)建難度，減少后續(xù)實(shí)驗(yàn)工作量，本實(shí)驗(yàn)以Toru Matsui等構(gòu)建的Rhodococcus-E．coli穿梭質(zhì)粒表達(dá)載體pNC9501為材料構(gòu)建載體，并研究HW-D3菌株的遺傳轉(zhuǎn)化方法。
　　 5．采用pNC9501質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化E．coli5α菌株，轉(zhuǎn)化率為1.01×102個(gè)轉(zhuǎn)化子/μg質(zhì)粒DNA。
　　 6．采用電轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化兩種方法研究HW-D3菌株的遺傳轉(zhuǎn)化方法，但均未得到質(zhì)粒pNC9501的陽性轉(zhuǎn)化子，可

5、能由于HW-D3菌株的限制性內(nèi)切酶系統(tǒng)活性較高，阻礙了外源DNA的轉(zhuǎn)入。有待進(jìn)一步研究建立、完善HW-D3菌株的遺傳轉(zhuǎn)化方法。
　　 7．為研究HW-D3菌株在環(huán)境中的檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)以E． coli WA803菌株為供體菌，以E． coli HB101菌株為輔助菌，采用三親接合的方法把帶有l(wèi)uxAB的pTR102質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體菌HW-D3菌株中，但未取得成功。
　　 8．采用真細(xì)菌通用FISH探針EUB338與純培養(yǎng)的HW-