血漿載脂蛋白apoai的分離純化

1、血漿載脂蛋白血漿載脂蛋白AIAI（ApoAIApoAI）的分離純化）的分離純化[目的與要求目的與要求]掌握并提高生化實驗基本原理及技術(shù)；了解生物大分子分離方案的設(shè)計及路徑；培養(yǎng)生物化學(xué)領(lǐng)域的科研設(shè)計的能力。[原理原理]生物大分子主要是指蛋白質(zhì)、酶、多糖和核酸。迄今已知的生物大分子的分離純化方法很多，主要利用它們之間特異性的差異，如分子量大小、分子形狀、酸堿性、溶解度、極性、電荷和對其它分子的親和力等建立起來的。其主要原理基本可歸納為兩個

2、方面，一是利用混合物中幾個組分分配系數(shù)的差異，把它們分配到兩相或多相中，如鹽析、鹽溶、有機溶劑沉淀、共沉淀、層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于單一的物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于不同區(qū)域而達(dá)到分離的目的，如電泳、超速離心、超濾等。目前純化蛋白質(zhì)的3種關(guān)鍵方法是電泳、超速離心和層析。由于生物大分子不能加熱熔化、汽化，所能分配的物相只限于固相和液相、并在這兩相之間交替進(jìn)行分離純化。因此，可將生物大分子制備方法按分子大小和形狀、帶電性質(zhì)

3、、溶解度、酸堿性、對其它分子的親和力等主要因素分類（見下表）。性質(zhì)具體方法分子大小和形狀溶解度電荷差異生物功能專一性差速離心、超濾、分子篩、透析鹽析、有機溶劑沉淀、等電點沉淀等電泳、等電聚焦、離子交換層析、吸附層析親和層析、疏水層析、共價層析在實際工作中，往往綜合使用上述幾種方法才能制備出一種純化的生物大分子。分離純化生物大分子總希望純度好、產(chǎn)率高，但實際上，兩者不能兼得。因此考慮分離純化條件和方法時，不得不在兩者間作適當(dāng)?shù)倪x擇。一般，

4、科研上更多考慮純度，工業(yè)生產(chǎn)上更多選擇產(chǎn)率。在進(jìn)行實踐前，應(yīng)進(jìn)行充分的調(diào)查研究，查閱有關(guān)文獻(xiàn)資料，對自己欲分離純化的物質(zhì)的物理、化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)先有一定的了解，然后進(jìn)行實驗工作。對于一個未知的生物大分子試樣進(jìn)行創(chuàng)造性的分離純化時，首先要確定研究的主要目的。如分離純化肽類物質(zhì)或酶類等，可參考已有的肽類或酶類物質(zhì)分離純化方法進(jìn)行反復(fù)的摸索比較，找到一些工作規(guī)律，逐步達(dá)到預(yù)期的結(jié)果。在分離純化工作中，另一重要工作是建立相應(yīng)的分析鑒定方法及生物

5、活性測定方法，即對目的活性物質(zhì)跟蹤分析，以便正確指導(dǎo)分離純化工作一步步順利深入進(jìn)行，若要提純一生物大分子達(dá)到一定純度，一般要經(jīng)過多種方法、步驟和不斷變化操作條件才能達(dá)到目的，因此，整個實驗過程中，各種方法的優(yōu)劣，選擇條件其效果的好壞，均需通過分析鑒定和生物活性測定來判斷。生物大分子一般需經(jīng)過下列步驟（或其中幾個步驟）才能分離純化達(dá)到所需的要求。一、前處理一、前處理包括生物材料的選擇及處理、細(xì)胞破碎、細(xì)胞器分離及目的物提取。選材主要根據(jù)實

6、驗?zāi)康亩?，從工業(yè)生產(chǎn)角度選材，注意選擇含量高、來源豐富、易獲得、制備工藝簡單、成本低的動植物組織或微生物材料原料。科研角度選材，則只需符合實驗預(yù)定目標(biāo)的要求即可。材料選定后，必須盡可能保持新鮮，盡快加工處理。如不立即進(jìn)行實驗或加工，則應(yīng)冷凍保存。若材料是提取液、體液（如血）、代謝排出液（如尿）、細(xì)胞外某些多肽激素、蛋白質(zhì)、酶等則不需破碎細(xì)胞。若為細(xì)胞內(nèi)生物活性物質(zhì)則需細(xì)胞破碎，如科研上材料處理量少，則可用勻漿器或超聲波處理法破碎；若處

7、理材料量較大，則可用高速組織搗碎機。操下較穩(wěn)定，所以盡可能采用堿性條件。四、結(jié)晶四、結(jié)晶結(jié)晶是蛋白質(zhì)分離的最后步驟。蛋白質(zhì)和酶的結(jié)晶影響因素和條件如下：1.純度蛋白質(zhì)純度愈高，就愈容易結(jié)晶。大多數(shù)生物大分子第一次得到結(jié)晶后，仍可以進(jìn)行多次重結(jié)晶，每次重結(jié)晶純度均有一定提高，直至恒定為止。2.濃度溶液愈濃，就愈容易結(jié)晶，若在過飽和的溶液中結(jié)晶，雜質(zhì)含量多，且晶形也不好，故樣品濃縮至一定濃度或所得沉淀溶解至合適濃度后，緩慢地加入鹽溶液或有機

8、溶劑至呈現(xiàn)微弱渾濁或略處于過飽和狀態(tài)，然后放置在一定溫度下，待其靜止地、慢慢地析出結(jié)晶，此時才酌情補充加入少量的鹽或有機溶劑使其結(jié)晶完全。如加入的鹽或溶劑過多，沉淀出來的不是晶體，可逐滴加入蒸餾水或?qū)λ肝觯偈钩恋磙D(zhuǎn)化為結(jié)晶。3.pH值結(jié)晶的溶液pH值一般選擇在被結(jié)晶的蛋白質(zhì)或酶的等電點處，可有利于晶體的析出。4溫度低溫條件下，蛋白質(zhì)和酶不僅溶解度低，而且不易變性失活。因此有利于這些物質(zhì)結(jié)晶。溫度可在410℃范圍內(nèi)選擇。5晶種蛋白質(zhì)和

9、酶不易結(jié)晶，如胰島素往往加入少量胰島素晶體可導(dǎo)致大量結(jié)晶的形成，有時用璃棒輕輕刮擦容器壁也可以達(dá)到此目的。五、干燥和樣品保存五、干燥和樣品保存生物大分子的制備得到所需的產(chǎn)品后，為了防止變質(zhì)、保持生物活性、易于保存和運輸，常常要干燥處理，最常用的方法是真空干燥和冷凍干燥，某些無活性核酸、微生物酶制劑和酪蛋白等工業(yè)產(chǎn)品則較多地應(yīng)用噴霧干燥、氣流干燥等直接干燥法。保存方法與生物大分子穩(wěn)定性及保持生物活性的關(guān)系很大，生物大分子的保存可分為干粉和

10、液態(tài)兩種。但不論是干粉或液態(tài)都應(yīng)避免長期暴露于空氣中防止微生物的污染。溫度對生物大分子的穩(wěn)定性和生物活性影響很大，故一般生物大分子物質(zhì)都在低溫(04℃)保存，保存時間也不宜過長，否則，會招致樣品的變質(zhì)或失活。干粉保存的制品一般比較穩(wěn)定，如制品含水量很低，在低溫情況下，生物大分子活性可在數(shù)個月甚至數(shù)年沒有顯著變化。儲藏方法也很簡單，只將干燥后的樣品置于干燥器內(nèi)(內(nèi)裝有干燥劑)密封，在04℃冰箱中保存即可。有時為了取樣方便和避免取樣時樣品吸

11、水和污染，可先將樣品分裝成許多小瓶，每次用時，只取出一小瓶。液態(tài)保存對保持生物大分子活性是不利的，故只在一些特殊情況下采用，并需要嚴(yán)格的防腐保護(hù)措施，保存時間也不宜過長，常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿等。蛋白質(zhì)和酶常用的穩(wěn)定劑有硫酸銨、蔗糖、甘油等，某些金屬離子如鈣、鎂、鋅等對某些酶也有一定的保護(hù)作用。在生物大分子分離提純的過程中，經(jīng)常需要測定某一大分子的含量和某一大分子的提純程度(即跟蹤分析)。這些分析工作還包括鑒定最后制品的純度。

12、生物大分子含量的測定是一項復(fù)雜而重要的工作，除采用通用方法外，還常用特異的方法，無法逐一介紹，這里僅作一般性方法介紹。測定多糖總量常用的方法有：菲林試劑法、蒽酮法、旋光法等。測定蛋白質(zhì)和酶總量常用的方法有：凱氏定氮法、雙縮脲、Folin酚試劑法、Bied染色測定法、紫外吸收法等。測定蛋白質(zhì)混合物中某一特定蛋白質(zhì)的含量通常要用具有高度特異性的生物學(xué)方法。具有酶或激素性質(zhì)的蛋白質(zhì)可以利用它們的酶活性或激素活性來測定含量；利用抗體抗原反應(yīng)，也