分子生物學(xué)結(jié)課論文

1、基因編輯技術(shù)的研究進(jìn)展基因編輯技術(shù)的研究進(jìn)展摘要：基因組編輯是建立在基因靶向修飾的基礎(chǔ)上，對生物基因組進(jìn)行改造的一項(xiàng)新技術(shù)。通過利用人工核酸酶ZFn、TALEN和細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)CRISPR，可在靶位點(diǎn)制造DNA雙鏈切口進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制，通過同源重組修復(fù)或非同源末端連接途徑實(shí)現(xiàn)基因敲除、替換和糾正。對目前3個(gè)主要的基因編輯技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展作一綜述。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞：基因編輯；鋅指核酸酶；TALEN；CRISPRCas9Abstr

2、act:GenomeEditingisbuiltonthebasisofgenetargetedmodificationofthegenomeofanewbiotechnologytransfmation.ThroughtheuseofartificialnucleasesZFnTALENacquiredimmunesystemsbacterialCRISPRcanbemanufacturedatthetargetpointthenin

3、ducedDNAdoublestrincisionendogenousrepairmechanismswithinthecellconnectedwaytoachievegeneknockoutbyhomologousrecombinationnonhomologousendrepairInadditionthereplacementcrection.Applicationdevelopmentofthecurrentthreemajg

4、eneeditingtechniquesarereviewed.Keywds:GeneEditingZincfingernucleaseTALENCRISPRCas9.引言：21世紀(jì)以來，科學(xué)家一直在尋求更加精確的方法對特定的基因進(jìn)行敲除或者靶向修飾。20世紀(jì)80年代，研究者們可以利用同源重組的方法來對特定的基因進(jìn)行靶向修飾，但由于自然重組的過程非常罕見，所以，這種方法效率非常低，只能達(dá)到106。之后的研究發(fā)現(xiàn)，真核細(xì)胞的染色體發(fā)生雙鏈

5、斷裂時(shí)，細(xì)胞會通過DNA同源重組或者非同源末端連接機(jī)制修復(fù)雙鏈斷裂[1]，在修復(fù)過程中會出現(xiàn)高幾率的基因缺失、插入和改變。所以，利用各種方法在染色體上的特定位點(diǎn)進(jìn)行精確切割誘發(fā)DNA損傷修復(fù)，使得對真核生物進(jìn)行精確的基因操作成為可能，以此實(shí)現(xiàn)特定細(xì)胞組織的遺傳操作[7]。2011年，人工核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)被NatureMethods雜志評選為年度最受關(guān)注的技術(shù)成果。這3種酶包括有3個(gè)主要的類型——鋅指核酸酶(zincfinger

6、nucleasesZFn)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(tranionactivatlikeeffectnucleasesTALEN)，以及歸巢核酸內(nèi)切酶(meganuclease)[5]。本文主要通過這三種物質(zhì)來介紹基因編輯技術(shù)的進(jìn)展。1基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)的初現(xiàn)——鋅指核酸酶(zincfingernucleases)1.1鋅指核酸酶的結(jié)構(gòu)及作用原理鋅指核酸酶的結(jié)構(gòu)及作用原理鋅指(zincfingerZF)是一種常見的DNA結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)

7、基元，每個(gè)鋅指可直接特異識別DNA雙螺旋中3個(gè)連續(xù)的核苷酸。人工串聯(lián)3~6個(gè)識別不同靶位點(diǎn)序列的重組鋅指結(jié)構(gòu)，能夠與靶序列特異性結(jié)合[1]。將多個(gè)鋅指串聯(lián)形成的ZFP結(jié)構(gòu)域與IIs型限制性內(nèi)切酶FokI的切割結(jié)構(gòu)域相連接，就可構(gòu)建成鋅指核酸酶(ZFn)，實(shí)現(xiàn)對靶序列的切割。增加串連鋅指的數(shù)目可識別更長的靶序列同時(shí)也就增加了DNA靶向修飾的特異性[8]。由于FokI需要二聚化來切割DNA，所以，設(shè)計(jì)好的兩個(gè)互補(bǔ)的ZFn分子同時(shí)與靶位點(diǎn)結(jié)合

8、，當(dāng)兩個(gè)互補(bǔ)的ZFn分子間相距恰當(dāng)?shù)木嚯x時(shí)(6~8bp)，F(xiàn)okI結(jié)構(gòu)域?qū)⒍刍⑶懈頓NA，從而可特異性地在基因組特定位點(diǎn)切斷DNA形成“雙鏈斷裂缺口”。雙鏈斷裂可以啟動細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，一方面細(xì)胞通過錯(cuò)配率很高的“非同源重組末端連接”機(jī)制修復(fù)雙鏈斷裂，從而在ZFn靶位點(diǎn)40%。目前，TALEN也像ZFn一樣，被應(yīng)用到了不同種的細(xì)胞及生物的基因組編輯中。至今為止，研究者們已經(jīng)應(yīng)用TALENs對果蠅、蛔蟲、斑馬魚、青蛙、大鼠和

9、豬等模式生物[7]進(jìn)行了基因組定點(diǎn)編輯[11]。而使用TALEN技術(shù)對牛、蟋蟀和家蠶等非模式生物進(jìn)行內(nèi)源基因的定點(diǎn)修飾也有報(bào)道。在目前的研究中，大多數(shù)研究者都使用一對TALENs對目標(biāo)基因進(jìn)行敲除，也有一些報(bào)道同時(shí)使用了兩對TALEN對同一條染色體上的兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行敲除，使基因組缺失更大的片段。同樣的，也已經(jīng)有研究者利用TALEN和同源片段的引入實(shí)現(xiàn)了在斑馬魚和人的基因組中進(jìn)行定點(diǎn)插入[10]。在各種遺傳疾病的治療方面，TALEN技術(shù)的高

10、精確性使得對這些錯(cuò)誤基因的修飾比ZFn更具潛力。Mussolino等利用TALEN和ZFn兩個(gè)技術(shù)對人胚肺293細(xì)胞的CCR5及CCR2位點(diǎn)中19bp的靶序列成功進(jìn)行了定點(diǎn)敲除，且TALEN的脫靶切割幾率比ZFn要低得多。Sun等利用設(shè)計(jì)的一對TALEN和同源性序列成功地對缺陷型β珠蛋白基因進(jìn)行了更改，使其恢復(fù)到正常序列。2.3TALEN的優(yōu)勢和局限的優(yōu)勢和局限相比ZFn技術(shù)，TALEN使用了TALE分子代替ZF作為人工核酸酶的識別結(jié)構(gòu)

11、域，極好地解決了ZF對于DNA序列識別特異性低的問題。TALE蛋白與DNA堿基是一一對應(yīng)的，并且對堿基的識別只由2個(gè)氨基酸殘基決定，這相對于ZFn的設(shè)計(jì)要簡單得多。但是在構(gòu)建過程中，TALE分子的模塊組裝和篩選過程比較繁雜，需要大量的測序工作，對于普通實(shí)驗(yàn)室的可操作性較低，而商業(yè)化公司構(gòu)建也需要花費(fèi)上千美元，使用成本較高；并且，TALEN的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量要比ZFn大得多，過大的蛋白質(zhì)分子往往會增加分子操作的難度，去除TALEN分子的

12、不必要結(jié)構(gòu)或者縮短識別序列的長度能一定程度地減輕影響，但是卻有可能造成識別特異性降低而導(dǎo)致脫靶切割，引起細(xì)胞毒性。3基因組編輯技術(shù)的新方向——CRISPRCas93.1CRISPRCas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及作用原理系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及作用原理TALEN對于靶序列識別的精確性使得該技術(shù)在近3年來得以飛速發(fā)展，但是其構(gòu)建復(fù)雜，并且較大的相對分子質(zhì)量在某些情況下使用困難也制約了其應(yīng)用前景。自2002年以來，CRISPR一直以其奇特的結(jié)構(gòu)與特殊的功能吸引著各

13、國科學(xué)家們的共同關(guān)注。它的結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，長度約25~50bp的重復(fù)序列(repeats)被間區(qū)序列(spacers)間隔。2005年，Cas系統(tǒng)(CRISPRassociatedsequencessystemCASs)被發(fā)現(xiàn)在原核生物中表現(xiàn)出某種獲得性免疫功能[2]，能使宿主獲得抵抗噬菌體、質(zhì)粒等外來DNA入侵的免疫能力。CRISPRCas系統(tǒng)的作用機(jī)制大體可分為3個(gè)不同階段：在噬菌體侵入的起始階段，Cas蛋白復(fù)合物靶向裂解噬菌體基因組

14、中短的原型間隔序列，這些原型間隔序列整合到宿主基因組中CRISPR位點(diǎn)的5′端；然后這些短的摻入的間隔序列被轉(zhuǎn)錄成crRNAs；當(dāng)宿主再被噬菌體感染時(shí)，crRNAs作為模板通過Cas復(fù)合物靶向降解噬菌體DNA。CRISPR系統(tǒng)大致分為3類，其中I型及III型CRISPR系統(tǒng)由復(fù)雜的Cas復(fù)合物介導(dǎo)DNA或RNA的降解，而在產(chǎn)膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)中發(fā)現(xiàn)的II型CRISPR系統(tǒng)組分較為簡單，只需要Cas9和

15、兩個(gè)非編碼RNA，3個(gè)組分即可介導(dǎo)外源DNA片段的靶向降解，所以目前針對CRISPRCas9研究較多。在CRISPRCas9系統(tǒng)中，外源的DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)菌的RNaseIII催化crRNA的成熟，成熟的crRNA通過堿基配對與tracrRNA結(jié)合，形成雙鏈RNA構(gòu)[3]。這一crRNA:tracrRNA二元復(fù)合體指導(dǎo)Cas9蛋白在crRNA引導(dǎo)序列靶標(biāo)的特定位點(diǎn)剪切雙鏈DNA，在與crRNA引導(dǎo)序列互補(bǔ)的位點(diǎn)，Cas9蛋白的HNH核

16、酸酶結(jié)構(gòu)域剪切互補(bǔ)鏈，而Cas9RuvCI結(jié)構(gòu)域剪切非互補(bǔ)鏈。3.2CRISPRCas9系統(tǒng)在基因組編輯中的應(yīng)用系統(tǒng)在基因組編輯中的應(yīng)用利用CRISPRCas9系統(tǒng)對DNA分子的靶向切割特性，使其可以被用于定向的基因修飾。2012年，來自加州大學(xué)伯克利分校的DouDNA研究小組首先利用人工設(shè)計(jì)的crRNAs序列，使用產(chǎn)膿鏈球菌的CRISPRCas9系統(tǒng)對體外的DNA靶序列進(jìn)行了精確切割，并且把crRNA:tracrRNA二元復(fù)合體改造為